Ekzosomlar, proteinler, lipitler, mRNA, miRNA ve DNA dahil olmak üzere orijinal hücreden türetilen karmaşık bir içerik kargosu içerir. Kredi: https://www.technologynetworks.com
İçindekiler
Ekzosom izolasyon yöntemlerine genel bakış
Ekzosomlar nelerdir?
Ekzosomlar, endosomal kökenli hücre dışı veziküllerin bir sınıfıdır ve genellikle 30-150 nm çapındadır; en küçük hücre dışı vezikül türüdür. 1 Bir lipit çift tabakasıyla sarılmış olan ekzosomlar, proteinler, lipitler, mRNA, miRNA ve DNA dahil olmak üzere orijinal hücreden türetilen karmaşık bir içerik kargosunu taşıyan hücre dışı ortama salınır. 2 Ekzosomlar , çok veziküllü cisimlerin hücre dışı boşluğa füzyonu ve ekzositozu yoluyla nasıl oluştuklarına göre tanımlanır .
Çok veziküler cisimler* , erken ve geç endosomlar arasında ara madde olarak görev yapan endositotik yoldaki benzersiz organellerdir . 3 Çok veziküler cisimlerin temel işlevi, başka yerlerde geri dönüştürülecek bileşenleri lizozomlar tarafından parçalanacak olanlardan ayırmaktır. 4 Çok veziküler cisimler içinde biriken veziküller, sitoplazma içindeyken intraluminal veziküller olarak kategorize edilir ve hücreden serbest bırakıldıklarında ekzosomlar olarak kategorize edilir.
*Kafa karıştırıcı bir şekilde literatürde tutarsızlıklar bulunmaktadır; bazı kaynaklar multiveziküler cisimleri geç endosomlardan ayırırken, diğerleri ikisini birbirinin yerine kullanmaktadır.
Bunlar neden ilgi çekici ve hangi rollere sahipler?
Ekzosomlar hücre biyolojisindeki rolleri ve potansiyel terapötik ve tanısal uygulamaları nedeniyle genel ilgi görmektedir . Başlangıçta ekzosomların sadece hücresel atık ürünleri olduğu düşünülüyordu, ancak işlevlerinin artık atık gidermenin ötesine uzandığı bilinmektedir. Ekzosomlar yeni bir hücre iletişimi modunu temsil eder ve sağlık ve hastalıkta bir dizi biyolojik sürece katkıda bulunur. 2
Eksozomların etkilerini gösterdiği düşünülen ana mekanizmalardan biri, eksozomla ilişkili RNA'nın alıcı hücrelere aktarılmasıdır; burada protein makinelerini etkilerler. Bunu destekleyen kanıtlar giderek artmaktadır; örneğin alıcı hücrelerde sağlam ve işlevsel eksozomal RNA'nın tanımlanması ve belirli RNA bağlayıcı proteinlerin RNA'nın hedef hücrelere aktarılmasında olası oyuncular olarak tanımlanması gibi. 5 , 6 MikroRNA'lar ve uzun kodlamayan RNA'lar eksozomlar tarafından taşınır ve gen ifadesini değiştirirken proteinler (örneğin ısı şoku proteinleri, sitoskeletal proteinler, yapışma molekülleri, membran taşıyıcı ve füzyon proteinleri) doğrudan hedef hücreleri etkileyebilir. 7 , 8
Ekzosomlar hem sağlık hem de hastalığın habercileri olarak tanımlanmıştır. Normal fizyolojik koşullar için gerekli olmalarına rağmen, hastalık durumlarında hücresel stresi ve hasarı güçlendirmek için de hareket ederler. 2
Bunlar nasıl üretilir?
Çok veziküllü gövdeler , membranla çevrili intraluminal veziküller içeren endosomların özel bir alt kümesidir. İntraluminal veziküller esasen ekzosomların öncülleridir ve çok veziküllü gövdenin lümenine tomurcuklanarak oluşurlar. Çoğu intraluminal vezikül, daha sonraki bozunma için lizozomlarla birleşirken, diğerleri hücre dışı boşluğa salınır. 9 , 10 Hücre dışı boşluğa salgılanan intraluminal veziküller ekzosom haline gelir. Bu salınma, çok veziküllü gövde plazma membranıyla birleştiğinde gerçekleşir.
Şekil 1: Ekzosomların oluşumu ve bozunumu. Kaynak: Technology Networks.
Bu, aktif bir araştırma alanıdır ve ekzosom salınımının nasıl düzenlendiği henüz bilinmemektedir. Ancak, görüntüleme protokollerindeki son gelişmeler, ekzosom salınım olaylarının yüksek uzaysal-zamansal çözünürlükte görüntülenmesine olanak tanıyabilir. 11
Hastalıkta nasıl bir rol oynuyorlar?
Ekzosomlar nörodejeneratif hastalıklar, kanser, karaciğer hastalığı ve kalp yetmezliği gibi çeşitli rahatsızlıklarla ilişkilendirilmiştir. Diğer mikroveziküller gibi, ekzosomların işlevi muhtemelen taşıdıkları kargoya bağlıdır ve bu da üretildikleri hücre tipine bağlıdır. 12 Araştırmacılar, aşağıdakiler de dahil olmak üzere bir dizi yaklaşımla hastalıktaki ekzosomları incelemiştir:
kültürlenmiş hücrelerden ekzosomların izole edilmesi ve farklı hücre kültürü çalışmalarında etkilerinin gözlemlenmesi
Çeşitli sağlıklı ve hastalıklı biyosıvılardaki ekzosomların karşılaştırılması
ekzosom salgılanmasını bloke etmek ve değişiklikleri gözlemlemek
Kanserde ekzosomların metastatik yayılma, ilaç direnci ve anjiyogenezde birden fazla rolü vardır. Özellikle ekzosomlar, göç eden tümör hücreleri için alan yaratmak üzere hücre dışı matrisi değiştirebilir. 13 , 14 Birçok çalışma ayrıca ekzosomların tümör baskılanması ve hücre dışı matris bozulmasıyla ilgili genleri etkileyerek kanser hücrelerinin göçünü, istilasını ve salgılanmasını artırabileceğini göstermektedir. 15 , 16
Genel hücre çapraz konuşması yoluyla, ekzosomal miRNA ve lncRNA kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), astım, tüberküloz ve interstisyel akciğer hastalıkları dahil olmak üzere akciğer hastalıklarının ilerlemesini etkiler. Oksidan maruziyeti gibi stres faktörleri ekzosomların salgılanmasını ve yükünü etkileyebilir ve bu da inflamatuar reaksiyonları etkiler. 17 Hastalıklı durumlarda değişen ekzosomal profiller ayrıca nörodejeneratif hastalıklar ve ruhsal bozukluklar gibi birçok başka durumda da ekzosomlar için bir rol olduğunu ima eder. 18 , 19
Bakterilere maruz kalan hücreler, toksinlere karşı yem görevi gören ekzosomlar salgılarlar ve bu da enfeksiyon sırasında koruyucu bir etki olduğunu gösterir. 20 Nöral devre gelişiminde ve diğer birçok sistemde, ekzosomal sinyallemenin, örtüşen ve bazen karşıt sinyalleme ağlarının bir toplamı olması muhtemeldir. 21
Tanıda nasıl kullanılabilirler?
Ekzosomlar, içerikleri köken hücrelerinin moleküler imzaları olduğundan potansiyel biyobelirteçler olarak işlev görebilir. Lipid çift tabakası nedeniyle, ekzosomal içerikler nispeten stabildir ve harici proteazlara ve diğer enzimlere karşı korunmuştur, bu da onları çekici tanı araçları haline getirir. Ekzosomal miRNA ve lncRNA profillerinin, sağlıklı insanlara kıyasla belirli patolojileri olan hastalarda farklı olduğuna dair artan raporlar vardır. 17 Sonuç olarak, kanser, diyabet ve diğer hastalıkların erken teşhisi için ekzosom tabanlı tanı testleri takip edilmektedir. 22 , 23
Birçok ekzosomal protein, nükleik asit ve lipit, klinik açıdan potansiyel olarak önemli biyobelirteçler olarak araştırılmaktadır. 24 Fosforilasyon proteinleri, dondurucuda beş yıl sonra bile ekzosomal örneklerden ayrılabilen umut verici biyobelirteçlerdir 25 ve ekzosomal mikroRNA'nın da oldukça kararlı olduğu görülmektedir. Ekzosomlar ayrıca çok çeşitli biyosıvılarda (kan, idrar, tükürük, gözyaşı, asit, semen, kolostrum, anne sütü, amniyon sıvısı ve beyin omurilik sıvısı dahil) mevcut oldukları için oldukça erişilebilirdir ve bu da sıvı biyopsiler için birçok fırsat yaratır.
Ekzosomların terapötik uygulamaları
Ekzosomlar, bir dizi potansiyel terapötik uygulamada kullanılmak üzere takip edilmektedir. Dışarıdan modifiye edilmiş veziküller toksisite ve hızlı temizlemeden muzdaripken, doğal olarak oluşan veziküllerin zarları daha iyi tolere edilir, düşük immünogenite ve hücre dışı sıvıda yüksek bir dayanıklılık sunar. 26 Bu "doğal olarak donatılmış" nanoveziküller terapötik olarak hedeflenebilir veya ilaç dağıtım sistemleri olarak tasarlanabilir.
Ekzosomlar, yüklerini ilettikleri alıcı hücrelere hedeflenmelerine olanak tanıyan yüzey molekülleri taşır. Bu, onları hastalıklı dokulara veya organlara hedeflemek için kullanılabilir. 26 Ekzosomlar, en azından belirli koşullar altında kan-beyin bariyerini geçebilir 27 ve küçük moleküller, RNA terapileri, proteinler, viral gen terapisi ve CRISPR gen düzenlemesi dahil olmak üzere bir dizi terapiyi iletmek için kullanılabilir.
İlaç yüklü ekzosomlar oluşturmaya yönelik farklı yaklaşımlar şunları içerir :
donör hücrelerden saflaştırılmış ekzosomlara bir ilaç dahil etmek
Hücreleri daha sonra ekzosomların içinde bulunan bir ilaçla yükleme
Hücrelere, daha sonra ekzosomların içinde bulunan terapötik olarak aktif bileşikleri kodlayan DNA'nın aktarılması
Ekzosomlar, kanser hücrelerine saldırmada kimerik antijen reseptörü T (CAR-T) hücrelerini tamamlamanın bir yolu olarak büyük bir potansiyele sahiptir. CAR-T hücrelerinden salınan CAR ekzosomları, yüzeylerinde CAR taşır ve yüksek düzeyde sitotoksik moleküller ifade eder ve tümör büyümesini engeller. 28 İlişkili antijenleri taşıyan kanser hücresinden türetilen ekzosomların ayrıca bir antitümör bağışıklık tepkisi başlattığı gösterilmiştir. 29
İzolasyon ve tespit yöntemleri
Ekzosomların saflaştırılması , translasyonel araçların geliştirilmesinde önemli bir zorluktur . Ekzosomlar, mikroveziküller (plazma membranından dökülen, ektozomlar veya dökülen veziküller olarak da adlandırılan) ve apoptotik cisimler gibi diğer farklı hücre dışı vezikül popülasyonlarından ayırt edilmelidir. 30 Ultra santrifüjleme, ekzosom izolasyonu için altın standart olarak kabul edilmesine rağmen, birçok dezavantajı vardır ve şu anda ekzosom izolasyonu için alternatif yöntemler aranmaktadır. Ekzosom izolasyonu aktif bir araştırma alanıdır (bkz. Tablo 1) ve birçok araştırma grubu, yol boyunca ilgili düzenleyici engelleri aşarken aşağıda listelenen dezavantajların üstesinden gelmenin yollarını aramaktadır.
Tablo 1: Ekzosom izolasyon yöntemlerine genel bakış
Yöntem | Yöntemin genel görünümü | Avantajları | Dezavantajları |
Farklı bileşenleri seçici olarak çökeltme girişimleri. Örnekler, hücreleri, hücresel artıkları ve makromoleküler proteinleri çıkarmak için artan santrifüjleme kuvvetleri ve süreleriyle ardışık turlarda santrifüjlenir, ardından süpernatanttaki ekzosomları elde etmek için ultra santrifüjleme (70 dakika boyunca 100.000xg'de) yapılır. | Kültür üst sıvısı gibi büyük numunelerden ekzosomların çıkarılması için uygundur. | Diğer ekstraselüler vezikül tiplerinin benzer sedimantasyon özelliklerine sahip olması nedeniyle izole edilen ekzosomların düşük verimi ve düşük saflığı oluşur. Emek yoğun, zaman alıcı ve büyük miktarda numune gerektirdiği için düşük verimlilik. özel ekipman. Yüksek santrifüj kuvveti ekzosom bütünlüğüne zarar verebilir | |
Bileşik polimerizasyon çökeltisi ilkesine dayanır. Numuneler, belirli bir boyuttaki ekzosomları yakalayan ağ benzeri bir polimerik ağ oluşturmak üzere reaksiyona giren bir reaktifle karıştırılır. | Jel filtrasyon kromatografisi ve diferansiyel ultra santrifüjlemeye karşı karşılaştırmalı bir çalışmada en yüksek verimi üretti. Hızlı, basit adımlar, yalnızca temel bir santrifüj gerektirir. | Kirlilik; sonraki analizleri olumsuz etkileyebilecek bazı kirleticiler ekzosomlarla birlikte eş zamanlı olarak ekstrakte edilebilir. | |
Jel filtrasyonu/boyut dışlama kromatografisi (ticari kitler) 34 | Numuneler, büyüklüklerine göre kirleticileri dışlayan kolonlardan geçirilir. | Hızlı yöntem. | Ekzozomal proteinin serum protein kontaminasyonu göstermesi proteomik analizleri sınırladı. |
İmmüno manyetik boncuklar kullanılarak afinite saflaştırma (ticari kitler) 32 | Ekzosom ilişkili reseptör moleküllerine karşı antikorlarla kaplanmış manyetik parçacıklar, ekzosom-boncuk kompleksleri oluşturmak için numuneyle inkübe edilir. Yönlü hareketi indüklemek ve ekzosomları numuneden ayırmak için manyetik bir alan uygulanır. | Hedefe özgü, çıkarılan ekzosomların bütünlüğünü garanti eder, nispeten kolaydır ve pahalı enstrümantasyon gerektirmez. Belirli belirteçlerin ifadesine dayanarak belirli ekzosom alt popülasyonları çıkarılabilir. | Eksozomları manyetik boncuklardan ayırmak zorlu bir iştir. |
Karıştırılmış ultrafiltrasyon 32 | Bir ultrafiltrasyon membranı, belirli bağıl moleküler kütleye sahip bileşenlerin geçmesine veya kesilmesine izin verir. Dışarıdan sağlanan nitrojen, numunenin membrandan geçmesine neden olur. | Ultra santrifüjlemeden daha az zaman alır ve ultra santrifüj ihtiyacını ortadan kaldırır. Kültür süpernatantı dahil olmak üzere büyük örneklerden ekzosomların çıkarılması için uygundur. | Son ürünün saflığının yetersiz olması. |
Çift filtrasyon mikroakışkan cihazı 32 | Bir mikroakışkan cihaz, boyut dışlama kromatografisinin prensiplerine göre çalışan iki membran (200 ve 30 nm çapında gözenek boyutlarına sahip) içerir. 200 nm'den büyük bileşenler membran tarafından dışlanır ve 30 nm'den küçük parçacıklar atık odasına geçer. 30 ile 200 nm arasındaki boyuttaki parçacıklar numune odasında kalır. | Ultra santrifüjlemeden daha ucuz ve daha etkilidir. | Eksozomlar filtrasyon sırasında sıkışıp zarar görebilir. |
Nanoplazmonla güçlendirilmiş saçılma 35 | Ekzosomal membran belirteçlerine karşı antikorlar, bir numunedeki ekzosomları yakalamak için bir sensör çipi üzerindeki bir silika yüzeye konjuge edilir. Antikor kaplı altın nanopartikül probları (GNP'ler) eklenir ve ekzosomlarla kompleksler oluşturur ve manyetik bir alan kullanılarak ayrılır. Karanlık alan mikroskobu altında, GNP'ler mevcut ekzosomları yansıtmak için farklı renkler saçar. | Hızlı, yüksek verimli, hassas ve spesifik. | Antikorların yüksek maliyeti. Karanlık alan mikroskobu altında radyasyonu tespit etmek için karmaşık istatistiksel araçlara ihtiyaç vardır. |
Çip üzerinde laboratuvar cihazları | Yaklaşımlar arasında akustik nanofiltrasyon, immünoafinite, filtrasyon, nanoteller üzerinde tutma, viskoelastik akış ayırma ve yanal yer değiştirme yer almaktadır. 36 | Yüksek verimli uygulamalar için ölçeklenebilirlik, düşük reaktif tüketimi ve taşınabilirlik potansiyeli. | Hassasiyet ve tespit limitleri değişiklik göstermektedir. |
Referanslar:
1. Brennan K, Martin K, FitzGerald SP, ve diğerleri. İnsan serumundaki protein ve lipid parçacıklarından ekstraselüler veziküllerin izolasyonu ve ayrılması için yöntemlerin karşılaştırılması. Sci Rep . 2020;10(1):1039. doi: 10.1038/s41598-020-57497-7
2. Isola AL, Chen S. Ekzosomlar: Sağlık ve hastalığın habercileri. Curr Neuropharmacol 15(1):157-165. doi: 10.2174/1570159X14666160825160421
3. Gruenberg J, Stenmark H. Çok veziküllü endosomların biyogenezisi. Nat Rev Mol Cell Biol . 2004;5(4):317-323. doi: 10.1038/nrm1360
4. Piper RC, Katzmann DJ. Çok veziküllü cisimlerin biyogenezisi ve işlevi. Annu Rev Cell Dev Biol . 2007;23(1):519-547. doi: 10.1146/annurev.cellbio.23.090506.123319
5. Harding CV, Heuser JE, Stahl PD. Ekzosomlar: Üç on yıla ve geleceğe bakış. J Cell Biol . 2013;200(4):367-371. doi: 10.1083/jcb.201212113
6. Statello L, Maugeri M, Garre E, ve diğerleri. Farklı RNA tipleriyle etkileşime girebilen ekzosomlardaki RNA bağlayıcı proteinlerin tanımlanması: RBP ile kolaylaştırılmış RNA'ların ekzosomlara taşınması. PLOS ONE . 2018;13(4):e0195969. doi: 10.1371/journal.pone.0195969
7. Dehbashi Behbahani G, Khani S, Mahmoodzadeh Hosseini H, Abbaszadeh-Goudarzi K, Nazeri S. Alıcı kanser hücrelerinin genetik ve epigenetik değişimlerinde ekzosom içeriklerinin rolü. İran Temel Tıp Bilimleri Dergisi 2016;19(10):1031-1039. doi: 10.22038/ijbms.2016.7725
8. Di Leva G, Croce CM. Kanserin miRNA profili. Curr Opin Genet Dev . 2013;23(1):3-11. doi: 10.1016/j.gde.2013.01.004
9. Huotari J, Helenius A. Endozom olgunlaşması. EMBO Dergisi . 2011;30(17):3481-3500. doi: 10.1038/emboj.2011.286
10. van Niel G, D'Angelo G, Raposo G. Hücre dışı veziküllerin hücre biyolojisine ışık tutmak. Nat Rev Mol Cell Biol . 2018;19(4):213-228. doi: 10.1038/nrm.2017.125
11. Bebelman MP, Bun P, Huveneers S, van Niel G, Pegtel DM, Verweij FJ. Tek hücrelerden ekzosom salınımını ölçmek için çok veziküllü gövde-plazma membran füzyonunun gerçek zamanlı görüntülenmesi. Nat Protoc . 2020;15(1):102-121. doi: 10.1038/s41596-019-0245-4
12. Muralidharan-Chari V, Clancy JW, Sedgwick A, D'Souza-Schorey C. Mikroveziküller: kanser ilerlemesi sırasında hücre dışı iletişimin aracıları. J Cell Sci . 2010;123(10):1603-1611. doi: 10.1242/jcs.064386
13. Weidle UH, Birzele F, Kollmorgen G, Rüger R. Metastazda ekzosomların çoklu rolleri. Kanser Genomiği ve Proteomiği . 2017;14(1):1-15. doi: 10.21873/cgp.20015
14. Mu W, Rana S, Zöller M. Tümör ekzosomları tarafından konak matris modülasyonu hareketliliği ve invazivliği teşvik eder. Neoplazi . 2013;15(8):875-IN4. doi: 10.1593/neo.13786
15. Zhang L, Zhang S, Yao J, ve diğerleri. Mikroçevre kaynaklı PTEN kaybı, ekzosomal mikroRNA ile beyin metastaz büyümesini başlatır. Nature . 2015;527(7576):100-104. doi: 10.1038/nature15376
16. Wu D ming, Deng Shua, Liu T, Han R, Zhang T, Xu Y. TGF-β aracılı ekzosomal lnc-MMP2-2, MMP2 ekspresyonunu teşvik ederek akciğer kanseri hücrelerinin damar sistemine göçünü ve invazyonunu düzenler. Cancer Med . 2018;7(10):5118-5129. doi: 10.1002/cam4.1758
17. Li Y, Yin Z, Fan J, Zhang S, Yang W. Akciğer hastalıklarında ekzomal miRNA'ların ve lncRNA'ların rolleri. Sig Transduct Hedef Ter . 2019;4(1):1-12. doi: 10.1038/s41392-019-0080-7
18. Shi M, Liu C, Cook TJ, ve diğerleri. Plazma ekzosomal α-sinüklein muhtemelen MSS'den türetilmiştir ve Parkinson hastalığında artar. Acta Neuropathol . 2014;128(5):639-650. doi: 10.1007/s00401-014-1314-y
19. Saeedi S, Israel S, Nagy C, Turecki G. Zihinsel bozukluklarda ekzosomların ortaya çıkan rolü. Transl Psikiyatri . 2019;9(1):1-11. doi: 10.1038/s41398-019-0459-9
20. Keller MD, Ching KL, Liang FX, ve diğerleri. Sahte ekzosomlar bakteriyel toksinlere karşı koruma sağlar. Nature . 2020;579(7798):260-264. doi: 10.1038/s41586-020-2066-6
21. Sharma P, Mesci P, Carromeu C, ve diğerleri. Ekzosomlar nörogenezi ve devre montajını düzenler. Proc Natl Acad Sci . 2019;116(32):16086-16094. doi: 10.1073/pnas.1902513116
22. Halvaei S, Daryani S, Eslami-S Z, ve diğerleri. Kanser sıvı biyopsisinde ekzosomlar: Meme kanserine odaklanma. Mol Ther Nükleik Asitler . 2018;10:131-141. doi: 10.1016/j.omtn.2017.11.014
23. Chang W, Wang J. Ekzosomlar ve kodlamayan RNA kargoları, diabetes mellitus için yeni modülatörler olarak ortaya çıkıyor. Hücreler . 2019;8(8):853. doi: 10.3390/cells8080853
24. Huang T, Deng CX. Kanser Tanı ve Prognostik Biyobelirteçleri Olarak Ekzosomların Güncel İlerlemeleri. Int J Biol Sci . 2019;15(1):1-11. doi: 10.7150/ijbs.27796
25. Chen IH, Xue L, Hsu CC ve diğerleri. Meme kanseri için aday belirteçler olarak hücre dışı veziküllerdeki fosfoproteinler. Proc Natl Acad Sci . 2017;114(12):3175-3180. doi: 10.1073/pnas.1618088114
26. Batrakova EV, Kim MS. İlaç dağıtımı için doğal olarak donatılmış nano taşıyıcılar olan ekzosomların kullanımı. J Control Release . 2015;219:396-405. doi: 10.1016/j.jconrel.2015.07.030
27. Chen CC, Liu L, Ma F, ve diğerleri. İn vitro kan-beyin bariyeri modeli boyunca ekzosom göçünün açıklanması . Cel Mol Bioeng . 2016;9(4):509-529. doi: 10.1007/s12195-016-0458-3
28. Fu W, Lei C, Liu S, ve diğerleri. Etkili CAR-T hücrelerinden türetilen CAR ekzosomları güçlü antitümör etkilere ve düşük toksisiteye sahiptir. Nat Commun . 2019;10(1):4355. doi: 10.1038/s41467-019-12321-3
29. Yoshimura A, Sawada K, Kimura T. Ekzosom kanser immünoterapisi için potansiyel bir hedef midir? Ann Transl Med . 2017;5(5):117-117. doi: 10.21037/atm.2017.01.47
30. Weidle UH, Birzele F, Kollmorgen G, Rüger R. Metastazda ekzosomların çoklu rolleri. Kanser Genomiği Proteomik . 2017;14(1):1-15. doi: 10.21873/cgp.20015
31. Livshits MA, Khomyakova E, Evtushenko EG, ve diğerleri. Diferansiyel santrifüjleme ile ekzosomların izolasyonu: Yaygın olarak kullanılan bir protokolün teorik analizi. Sci Rep . 2015;5(1):17319. doi: 10.1038/srep17319
32. Yu LL, Zhu J, Liu JX ve diğerleri. İnsan örneklerinden ekzosomların ayrılması için geleneksel ve yeni yöntemlerin karşılaştırılması. BioMed Res. Int . 2018;2018:e3634563. doi: 10.1155/2018/3634563
33. Alvarez ML, Khosroheidari M, Ravi RK, DiStefano JK. Böbrek hastalığı biyobelirteçlerinin keşfi için farklı idrar ekzom izolasyon yöntemleri kullanılarak protein, mikroRNA ve mRNA verimlerinin karşılaştırılması. Kidney Int . 2012;82(9):1024-1032. doi: 10.1038/ki.2012.256
34. Patel GK, Khan MA, Zubair H, ve diğerleri. Optimum verim, saflık ve akış aşağı uygulamaları için kültür üst sıvısı kullanılarak ekzosom izolasyon yöntemlerinin karşılaştırmalı analizi. Sci Rep . 2019;9(1):5335. doi: 10.1038/s41598-019-41800-2
35. Liang K, Liu F, Fan J, ve diğerleri. Tanı ve tedavi takibi için plazma mikronumunelerindeki tümör kaynaklı ekstraselüler veziküllerin nanoplazmonik kantifikasyonu. Nat Biomed Eng . 2017;1(4):1-11. doi: 10.1038/s41551-016-0021
36. Contreras-Naranjo JC, Wu HJ, Ugaz VM. Ekzosom izolasyonu ve analizi için mikroakışkanlar: kişiselleştirilmiş tıp için sıvı biyopsiyi mümkün kılıyor. Lab Chip . 2017;17(21):3558-3577. doi: 10.1039/C7LC00592J
Ekzosomlar nelerdir?
Ekzosomlar, endosomal kökenli hücre dışı veziküller sınıfıdır ve genellikle 30-150 nm çapındadır - en küçük hücre dışı vezikül türüdür. Bir lipit çift tabakasıyla sarılmış olan ekzosomlar, proteinler, lipitler, mRNA, miRNA ve DNA dahil olmak üzere orijinal hücreden türetilen karmaşık bir içerik kargosu içeren hücre dışı ortama salınır. Ekzosomlar, çok veziküllü gövdelerin hücre dışı boşluğa füzyonu ve ekzositozu yoluyla nasıl oluştuklarına göre tanımlanır.
Exosomes: Definition, Function and Use in Therapy
Exosomes contain a complex cargo of contents derived from the original cell, including proteins, lipids, mRNA, miRNA and DNA. Credit: Technology Networks
What are exosomes?
Exosomes are a class of cell-derived extracellular vesicles of endosomal origin, and are typically 30-150 nm in diameter – the smallest type of extracellular vesicle.1 Enveloped by a lipid bilayer, exosomes are released into the extracellular environment containing a complex cargo of contents derived from the original cell, including proteins, lipids, mRNA, miRNA and DNA.2 Exosomes are defined by how they are formed – through the fusion and exocytosis of multivesicular bodies into the extracellular space.
Multivesicular bodies* are unique organelles in the endocytic pathway that function as intermediates between early and late endosomes.3 The main function of multivesicular bodies is to separate components that will be recycled elsewhere from those that will be degraded by lysosomes.4 The vesicles that accumulate within multivesicular bodies are categorized as intraluminal vesicles while inside the cytoplasm – and exosomes when released from the cell.
*Confusingly, there is inconsistency in the literature; while some sources differentiate multivesicular bodies from late endosomes, others use the two interchangeably.
Why are they of interest and what roles do they have?
Exosomes are of general interest for their role in cell biology, and for their potential therapeutic and diagnostic applications. It was originally thought that exosomes were simply cellular waste products, however their function is now known to extend beyond waste removal. Exosomes represent a novel mode of cell communication and contribute to a spectrum of biological processes in health and disease.2
One of the main mechanisms by which exosomes are thought to exert their effects is via the transfer of exosome-associated RNA to recipient cells, where they influence protein machinery. There is growing evidence to support this, such as the identification of intact and functional exosomal RNA in recipient cells and certain RNA-binding proteins have been identified as likely players in the transfer of RNA to target cells.5,6 MicroRNAs and long noncoding RNAs are shuttled by exosomes and alter gene expression while proteins (e.g. heat shock proteins, cytoskeletal proteins, adhesion molecules, membrane transporter and fusion proteins) can directly affect target cells.7,8
Exosomes have been described as messengers of both health and disease. While they are essential for normal physiological conditions, they also act to potentiate cellular stress and damage under disease states.2
How are they generated?
Multivesicular bodies are a specialized subset of endosomes that contain membrane-bound intraluminal vesicles. Intraluminal vesicles are essentially the precursors of exosomes, and form by budding into the lumen of the multivesicular body. Most intraluminal vesicles fuse with lysosomes for subsequent degradation, while others are released into the extracellular space.9,10 The intraluminal vesicles that are secreted into the extracellular space become exosomes. This release occurs when the multivesicular body fuses with the plasma membrane.
Figure 1: The formation and degradation of exosomes. Credit: Technology Networks.
This is an active area of research and it is not yet known how exosome release is regulated. However, recent advances in imaging protocols may allow exosome release events to be visualized at high spatiotemporal resolution.11
What role do they play in disease?
Exosomes have been implicated in a diverse range of conditions including neurodegenerative diseases, cancer, liver disease and heart failure. Like other microvesicles, the function of exosomes likely depends on the cargo they carry, which is dependent on the cell type in which they were produced.12 Researchers have studied exosomes in disease through a range of approaches, including:
isolating exosomes from cultured cells and observing their effect in different cell culture studies
comparing exosomes in various healthy and diseased biofluids
blocking exosome secretion and observing changes
In cancer, exosomes have multiple roles in metastatic spread, drug resistance and angiogenesis. Specifically, exosomes can alter the extracellular matrix to create space for migrating tumor cells.13,14 Several studies also indicate that exosomes can increase the migration, invasion and secretion of cancer cells by influencing genes involved with tumor suppression and extracellular matrix degradation.15,16
Through general cell crosstalk, exosomal miRNA and lncRNA affect the progression of lung diseases including chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, tuberculosis and interstitial lung diseases. Stressors such as oxidant exposure can influence the secretion and cargo of exosomes, which in turn affect inflammatory reactions.17 Altered exosomal profiles in diseased states also imply a role for exosomes in many other conditions such as in neurodegenerative diseases and mental disorders.18,19
Cells exposed to bacteria release exosomes which act like decoys to toxins, suggesting a protective effect during infection.20 In neuronal circuit development, and in many other systems, exosomal signaling is likely to be a sum of overlapping and sometimes opposing signaling networks.21
How can they be used in diagnostics?
Exosomes can function as potential biomarkers, as their contents are molecular signatures of their originating cells. Due to the lipid bilayer, exosomal contents are relatively stable and protected against external proteases and other enzymes, making them attractive diagnostic tools. There are increasing reports that profiles of exosomal miRNA and lncRNA differ in patients with certain pathologies, compared with those of healthy people.17 Consequently, exosome-based diagnostic tests are being pursued for the early detection of cancer, diabetes and other diseases.22,23
Many exosomal proteins, nucleic acids and lipids are being explored as potential clinically relevant biomarkers.24 Phosphorylation proteins are promising biomarkers that can be separated from exosomal samples even after five years in the freezer25, while exosomal microRNA also appears to be highly stable. Exosomes are also highly accessible as they are present in a wide array of biofluids (including blood, urine, saliva, tears, ascites, semen, colostrum, breast milk, amniotic fluid and cerebrospinal fluid), creating many opportunities for liquid biopsies.
Therapeutic applications of exosomes
Exosomes are being pursued for use in an array of potential therapeutic applications. While externally modified vesicles suffer from toxicity and rapid clearance, membranes of naturally occurring vesicles are better tolerated, offering low immunogenicity and a high resilience in extracellular fluid.26 These “naturally-equipped” nanovesicles could be therapeutically targeted or engineered as drug delivery systems.
Exosomes bear surface molecules that allow them to be targeted to recipient cells, where they deliver their payload. This could be used to target them to diseased tissues or organs.26 Exosomes may cross the blood-brain barrier, at least under certain conditions27 and could be used to deliver an array of therapies including small molecules, RNA therapies, proteins, viral gene therapy and CRISPR gene-editing.
Different approaches to creating drug-loaded exosomes include26:
incorporating a drug into exosomes that have been purified from donor cells
loading cells with a drug that is then contained within exosomes
transfecting cells with DNA encoding therapeutically-active compounds that are then contained within exosomes
Exosomes hold huge potential as a way to complement chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells in attacking cancer cells. CAR exosomes, which are released from CAR-T cells, carry CAR on their surface and express a high level of cytotoxic molecules and inhibit tumor growth.28 Cancer cell-derived exosomes carrying associated antigens have also been shown to recruit an antitumor immune response.29
Methods of isolation and detection
The purification of exosomes is a key challenge in the development of translational tools. Exosomes must be differentiated from other distinct populations of extracellular vesicles, such as microvesicles (which shed from the plasma membrane, also referred to as ectosomes or shedding vesicles) and apoptotic bodies.30 Although ultracentrifugation is regarded as the gold standard for exosome isolation, it has many disadvantages and alternative methods for exosome isolation are currently being sought. Exosome isolation is an active area of research (see Table 1) and many research groups are seeking ways to overcome the disadvantages listed below, while navigating the relevant regulatory hurdles along the way.
Table 1: An overview of exosome isolation methods
Method | Overview of method | Advantages | Disadvantages |
Attempts to selectively sediment different components. Samples are centrifuged in successive rounds with increasing centrifugation forces and durations to remove cells, cellular debris and macromolecular proteins, followed by ultracentrifugation (at 100,000x g for 70 minutes) to obtain the exosomes in the supernatant. | Suitable for the extraction of exosomes from large samples, such as culture supernatant. | Produces a low yield and low purity of the isolated exosomes as other types of extracellular vesicles have similar sedimentation properties. Low efficiency as it is labor-intensive, time-consuming and requires a large amount of sample. specialized equipment. High centrifugal force can damage exosome integrity | |
Based on the principle of compound polymerization precipitation. Samples are mixed with a reagent that reacts to form a mesh-like polymeric web that captures exosomes of a certain size. | Produced the highest yield in a comparative study against gel-filtration chromatography and differential ultracentrifugation. Fast, simple steps, requires only a basic centrifuge. | Impurity; certain contaminants that impair subsequent analysis may be co-extracted with the exosomes. | |
Gel-filtration/size-exclusion chromatography (commercial kits)34 | Samples are passed through columns that exclude contaminants based on size. | Fast method. | Exosomal protein showed serum protein contamination, limiting proteomic analyses. |
Affinity purification using immunomagnetic beads (commercial kits)32 | Magnetic particles coated with antibodies against exosome-associated receptor molecules are incubated with the sample to form exosome-bead complexes. A magnetic field is applied to induce directional movement and separate the exosomes from the sample. | Target-specific, ensures the integrity of the extracted exosomes, relatively easy and does not require expensive instrumentation. Specific exosome subpopulations can be extracted, based on the expression of specific markers. | Eluting the exosomes from the magnetic beads is a challenge. |
Stirred ultrafiltration32 | An ultrafiltration membrane allows components of specific relative molecular mass to pass through or be intercepted. Externally supplied nitrogen causes the sample to pass through the membrane. | Less time-consuming than ultracentrifugation and avoids the need for an ultracentrifuge. Suitable for the extraction of exosomes from large samples including culture supernatant. | Lack of purity of the end product. |
Double filtration microfluidic device32 | A microfluidic device contains two membranes (with pore sizes of 200 and 30 nm in diameter) that work following the principles of size-exclusion chromatography. Components larger than 200 nm are excluded by the membrane, and particles smaller than 30 nm pass into the waste chamber. Particles of a size between 30 and 200 nm remain in the sample chamber. | Inexpensive and more efficient than ultracentrifugation. | Exosomes may be squeezed and damaged during filtration. |
Nanoplasmon-enhanced scattering35 | Antibodies against exosomal membrane markers are conjugated to a silica surface on a sensor chip to capture exosomes in a sample. Antibody-coated gold nanoparticle probes (GNPs) are added and form complexes with the exosomes and are separated using a magnetic field. Under dark-field microscopy, GNPs scatter different colors to reflect the exosomes present. | Rapid, high-throughput, sensitive and specific. | High cost of antibodies. Complex statistical tools are required to detect radiation under dark-field microscopy. |
Lab-on-a-chip devices | Approaches include acoustic nanofiltration, immunoaffinity, filtration, trapping on nanowires, viscoelastic flow sorting and lateral displacement.36 | Scalable for high-throughput applications, low reagent consumption and potential for portability. | Sensitivity and detection limits vary. |
References:
1. Brennan K, Martin K, FitzGerald SP, et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Sci Rep. 2020;10(1):1039. doi: 10.1038/s41598-020-57497-7
2. Isola AL, Chen S. Exosomes: The messengers of health and disease. Curr Neuropharmacol 15(1):157-165. doi: 10.2174/1570159X14666160825160421
3. Gruenberg J, Stenmark H. The biogenesis of multivesicular endosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 2004;5(4):317-323. doi: 10.1038/nrm1360
4. Piper RC, Katzmann DJ. Biogenesis and function of multivesicular bodies. Annu Rev Cell Dev Biol. 2007;23(1):519-547. doi: 10.1146/annurev.cellbio.23.090506.123319
5. Harding CV, Heuser JE, Stahl PD. Exosomes: Looking back three decades and into the future. J Cell Biol. 2013;200(4):367-371. doi: 10.1083/jcb.201212113
6. Statello L, Maugeri M, Garre E, et al. Identification of RNA-binding proteins in exosomes capable of interacting with different types of RNA: RBP-facilitated transport of RNAs into exosomes. PLOS ONE. 2018;13(4):e0195969. doi: 10.1371/journal.pone.0195969
7. Dehbashi Behbahani G, Khani S, Mahmoodzadeh Hosseini H, Abbaszadeh-Goudarzi K, Nazeri S. The role of exosomes contents on genetic and epigenetic alterations of recipient cancer cells. Iran J Basic Med Sci. 2016;19(10):1031-1039. doi: 10.22038/ijbms.2016.7725
8. Di Leva G, Croce CM. miRNA profiling of cancer. Curr Opin Genet Dev. 2013;23(1):3-11. doi: 10.1016/j.gde.2013.01.004
9. Huotari J, Helenius A. Endosome maturation. The EMBO Journal. 2011;30(17):3481-3500. doi: 10.1038/emboj.2011.286
10. van Niel G, D’Angelo G, Raposo G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 2018;19(4):213-228. doi: 10.1038/nrm.2017.125
11. Bebelman MP, Bun P, Huveneers S, van Niel G, Pegtel DM, Verweij FJ. Real-time imaging of multivesicular body–plasma membrane fusion to quantify exosome release from single cells. Nat Protoc. 2020;15(1):102-121. doi: 10.1038/s41596-019-0245-4
12. Muralidharan-Chari V, Clancy JW, Sedgwick A, D’Souza-Schorey C. Microvesicles: mediators of extracellular communication during cancer progression. J Cell Sci. 2010;123(10):1603-1611. doi: 10.1242/jcs.064386
13. Weidle UH, Birzele F, Kollmorgen G, Rüger R. The multiple roles of exosomes in metastasis. Cancer Genomics & Proteomics. 2017;14(1):1-15. doi: 10.21873/cgp.20015
14. Mu W, Rana S, Zöller M. Host matrix modulation by tumor exosomes promotes motility and invasiveness. Neoplasia. 2013;15(8):875-IN4. doi: 10.1593/neo.13786
15. Zhang L, Zhang S, Yao J, et al. Microenvironment-induced PTEN loss by exosomal microRNA primes brain metastasis outgrowth. Nature. 2015;527(7576):100-104. doi: 10.1038/nature15376
16. Wu D ming, Deng S hua, Liu T, Han R, Zhang T, Xu Y. TGF-β-mediated exosomal lnc-MMP2-2 regulates migration and invasion of lung cancer cells to the vasculature by promoting MMP2 expression. Cancer Med. 2018;7(10):5118-5129. doi: 10.1002/cam4.1758
17. Li Y, Yin Z, Fan J, Zhang S, Yang W. The roles of exosomal miRNAs and lncRNAs in lung diseases. Sig Transduct Target Ther. 2019;4(1):1-12. doi: 10.1038/s41392-019-0080-7
18. Shi M, Liu C, Cook TJ, et al. Plasma exosomal α-synuclein is likely CNS-derived and increased in Parkinson’s disease. Acta Neuropathol. 2014;128(5):639-650. doi: 10.1007/s00401-014-1314-y
19. Saeedi S, Israel S, Nagy C, Turecki G. The emerging role of exosomes in mental disorders. Transl Psychiatry. 2019;9(1):1-11. doi: 10.1038/s41398-019-0459-9
20. Keller MD, Ching KL, Liang FX, et al. Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins. Nature. 2020;579(7798):260-264. doi: 10.1038/s41586-020-2066-6
21. Sharma P, Mesci P, Carromeu C, et al. Exosomes regulate neurogenesis and circuit assembly. Proc Natl Acad Sci. 2019;116(32):16086-16094. doi: 10.1073/pnas.1902513116
22. Halvaei S, Daryani S, Eslami-S Z, et al. Exosomes in cancer liquid biopsy: A focus on breast cancer. Mol Ther Nucleic Acids. 2018;10:131-141. doi: 10.1016/j.omtn.2017.11.014
23. Chang W, Wang J. Exosomes and their noncoding RNA cargo are emerging as new modulators for diabetes mellitus. Cells. 2019;8(8):853. doi: 10.3390/cells8080853
24. Huang T, Deng CX. Current Progresses of Exosomes as Cancer Diagnostic and Prognostic Biomarkers. Int J Biol Sci. 2019;15(1):1-11. doi: 10.7150/ijbs.27796
25. Chen IH, Xue L, Hsu CC, et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proc Natl Acad Sci. 2017;114(12):3175-3180. doi: 10.1073/pnas.1618088114
26. Batrakova EV, Kim MS. Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery. J Control Release. 2015;219:396-405. doi: 10.1016/j.jconrel.2015.07.030
27. Chen CC, Liu L, Ma F, et al. Elucidation of exosome migration across the blood–brain barrier model in vitro. Cel Mol Bioeng. 2016;9(4):509-529. doi: 10.1007/s12195-016-0458-3
28. Fu W, Lei C, Liu S, et al. CAR exosomes derived from effector CAR-T cells have potent antitumour effects and low toxicity. Nat Commun. 2019;10(1):4355. doi: 10.1038/s41467-019-12321-3
29. Yoshimura A, Sawada K, Kimura T. Is the exosome a potential target for cancer immunotherapy? Ann Transl Med. 2017;5(5):117-117. doi: 10.21037/atm.2017.01.47
30. Weidle UH, Birzele F, Kollmorgen G, Rüger R. The multiple roles of exosomes in metastasis. Cancer Genomics Proteomics. 2017;14(1):1-15. doi: 10.21873/cgp.20015
31. Livshits MA, Khomyakova E, Evtushenko EG, et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 2015;5(1):17319. doi: 10.1038/srep17319
32. Yu LL, Zhu J, Liu JX, et al. A comparison of traditional and novel methods for the separation of exosomes from human samples. BioMed Res. Int. 2018;2018:e3634563. doi: 10.1155/2018/3634563
33. Alvarez ML, Khosroheidari M, Ravi RK, DiStefano JK. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. 2012;82(9):1024-1032. doi: 10.1038/ki.2012.256
34. Patel GK, Khan MA, Zubair H, et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Sci Rep. 2019;9(1):5335. doi: 10.1038/s41598-019-41800-2
35. Liang K, Liu F, Fan J, et al. Nanoplasmonic quantification of tumour-derived extracellular vesicles in plasma microsamples for diagnosis and treatment monitoring. Nat Biomed Eng. 2017;1(4):1-11. doi: 10.1038/s41551-016-0021
36. Contreras-Naranjo JC, Wu HJ, Ugaz VM. Microfluidics for exosome isolation and analysis: enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab Chip. 2017;17(21):3558-3577. doi: 10.1039/C7LC00592J
What are exosomes?
Exosomes are a class of cell-derived extracellular vesicles of endosomal origin, and are typically 30-150 nm in diameter – the smallest type of extracellular vesicle. Enveloped by a lipid bilayer, exosomes are released into the extracellular environment containing a complex cargo of contents derived from the original cell, including proteins, lipids, mRNA, miRNA and DNA. Exosomes are defined by how they are formed – through the fusion and exocytosis of multivesicular bodies into the extracellular space.
Comments