Ekzosomlar için izolasyon yöntemlerindeki son gelişmeler

Jiahui Gao , Ang Li , Jie Hu , Linxiang Feng , Liu Liu , ve Zuojun Shen

Yazar bilgileri Makale notları Telif hakkı ve lisans bilgileri PMC Sorumluluk reddi

Özet

Ekzosomlar, hemen hemen tüm hücre tipleri tarafından salınabilen en küçük hücre dışı veziküllerdir ve boyutları 30 nm ile 150 nm arasında değişir. Sıvı biyopsilerin başlıca belirteci olarak ekzosomlar, hastalık teşhisi, tedavisi ve prognozu için büyük bir potansiyele sahiptir. Ancak, içsel heterojenlikleri, biyolojik sıvıların karmaşıklığı ve nanometre ölçeğindeki kirleticilerin varlığı, ekzosomların izolasyonunu büyük bir zorluk haline getirir. Ekzosomların geleneksel izolasyon yöntemleri, karmaşık ve zaman alıcı işlemlerle zahmetli ve zordur. Son yıllarda, mikroakışkan çiplerin, nanolitografinin, elektro-biriktirmenin ve diğer teknolojilerin ortaya çıkması, izolasyon yöntemlerinin birleşimini ve yenilikçiliğini teşvik etti. Bu yöntemlerin uygulanması, ekzosomların izolasyonuna ultra hızlı, taşınabilir entegrasyon ve düşük kayıp gibi çok önemli faydalar getirdi. İzolasyon veriminde, izolasyon saflığında ve klinik uygulamalarda önemli işlevsel iyileştirmeler vardır. Bu derlemede, ekzosom izolasyonuna yönelik bir dizi yöntem özetlenmiş, yeni ortaya çıkan yöntemlere vurgu yapılmış ve her yöntemin ilkeleri, avantajları ve dezavantajları da dahil olmak üzere derinlemesine karşılaştırması ve analizi sağlanmıştır.

Anahtar kelimeler: ekzosomlar, hücre dışı veziküller, izolasyon yöntemleri, izolasyon teknolojileri, inceleme

1. Giriş

Ekzosomlar, hücreler arası iletişimde, anjiyogenezde ( Geng vd., 2020 ) ve tümör oluşumunda ( Li vd., 2021 ) rol oynayabilen, hücre içi çok veziküllü cisimler tarafından salgılanan zarımsı veziküllerdir. Kanser ( Wu vd., 2021 ), bulaşıcı hastalıklar ( Shrivastava vd., 2021 ) ve kardiyovasküler hastalıkların ( Neves vd., 2022 ) erken teşhisinde önemli bir rol oynarlar. Ekzosomların biyolojik özellikleri ve işlevsel karakteristikleri yoğun bir şekilde incelenmiş olsa da, boyut, kargo ve köken açısından ekzosomların yüksek heterojenliği ( Han vd., 2021a ) ve lipoproteinler, retrovirüsler vb. gibi nanometre ölçeğindeki kirleticilerin varlığı, ekzosomların izolasyonu ve saflaştırılması için yöntemlerin geliştirilmesini sınırlamıştır.

Şimdiye kadar, ekzosom izolasyon yöntemleri sürekli olarak iyileştirilmektedir. Geleneksel yöntemler esas olarak diferansiyel ultra santrifüjleme, boyuta dayalı izolasyon ve polimer bazlı çökeltmeyi içerir. Bu yöntemler büyük hacimli numuneleri işlemek veya yüksek saflıkta numuneler elde etmek için kullanılabilir. Ancak, çoğu ekzosom izolasyon yöntemi yüksek verim ve saflığı garanti edemez. Bazı izolasyon yöntemleri sadece sıkıcı ve maliyetli olmakla kalmaz, aynı zamanda özel aletler de gerektirir. Ultra santrifüjleme gibi, ekzosomlar santrifüj kuvvetinin etkisi altında mekanik olarak kolayca hasar görür ve ekzosomların biyoaktivitesini ve morfolojik bütünlüğünü etkili bir şekilde korumak zordur.

Son yıllarda, mikroakışkanlık ( Hassanpour Tamrin ve diğerleri, 2021 ), nanolitografi, elektro-biriktirme, immünomanyetik boncuklar ve kovalent kimya gibi ortaya çıkan yöntemler ve teknolojiler, ekzosomların izolasyonu üzerinde önemli etkilere sahiptir (Şekil 1). Örnek olarak, alan akış izolasyonu ( Kim vd., 2022a ), etiketsiz manyetik izolasyon ( Zeng vd., 2021 ) ve işlevsel mikro/nanoyapılar ( Lim vd., 2022 ) ekzosomları verimli bir şekilde çıkarmak için kullanılabilir. Bu arada, ekzosomların izolasyonunu ve analizini, ekzosomların doğrudan karakterize edilebileceği ve akış aşağısı genomik ve proteomik için analiz edilebileceği bir platforma entegre etmek için mikroakışkan cihazlar geliştirilmiştir. Ek olarak, talep üzerine ekstraselüler veziküller (EVOD) çipi, akciğer kanseri kaynaklı ekzosomları izole etmek ve analiz etmek için kullanılabilir ( Kang vd., 2020 ).

Ortaya çıkan izolasyon yöntemleri ve teknolojileri ve ekzosomların ayırt edici özellikleri. Ekzosomların genellikle CD63, CD81, CD9, HSP70, HSP90, TSG101 ve Alix gibi belirteçleri ifade ettiği bulunmuştur. Şu anda, ekzosomlar basit ve hızlı, yüksek verim ve saflıkta, zamandan ve maliyetten tasarruf sağlayan izolasyon verimliliğine ulaşmak için nanolitografi, elektro-biriktirme, immünomanyetik boncuklar, kovalent kimya, DNAzim probları ve negatif manyetikelektroforez gibi çeşitli yöntemler ve teknolojilerle izole edilebilir.

Yüksek verim ve saflık sağlanırken, ekzosomların biyoaktivitesi ve yapısal bütünlüğü korunabilir. Sadece iyi ayırma ürünleri temelinde ekzosomlar etkili bir şekilde incelenebilir. Bu nedenle, uygun ayırma tekniğinin seçimi ekzosom araştırmalarının ön koşuludur. Bu derlemede, dikotomik boyut dışlama kromatografisi ( Guo vd., 2021a ), boyut dışlama kromatografisi ile birlikte ultra santrifüjleme ( Vergauwen vd., 2021 ) gibi geleneksel yöntemlerdeki iyileştirmeler ve yenilikler tanıtılmaktadır. Son iki yılda önerilen, parçacık ferrohidrodinamiği ilkesine dayalı etiketsiz nanopartikül ayrımı ( Liu vd., 2020 ) ve biyotin-avidin sistemleri ile birlikte DSPE-PEG türevleri ile ayırma ( Wei vd., 2021 ) gibi yeni ortaya çıkan yöntemler ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

2 Ekzosom izolasyonu için geleneksel yöntemlerin iyileştirilmesi

Ekzosom izolasyonu için geleneksel yöntemler arasında ultra santrifüjleme tabanlı yöntemler, boyut tabanlı yöntemler (boyut dışlama kromatografisi ve ultrafiltrasyon), çökeltme ve immünoafinite yakalama yer alır. İlk üç yöntem esas olarak ekzosomların boyutuna ve yoğunluğuna dayanır ve son yöntem esas olarak antikorlar veya aptamerler ile ekzosomal imza proteinleri arasındaki spesifik bağlanmaya dayanır. Her yöntemin karşılaştırması şu şekilde özetlenmiştir:tablo 1. Bu temelde, birçok araştırmacı mevcut yöntemleri entegre etti ve yeniledi. Örneğin, izolasyon için iyodiksanol yoğunluk gradyan santrifüjlemesiyle birleştirilmiş boyut dışlama kromatografisi kullanıldı ve yüksek verim ve saflık elde edildi ( Alameldin ve diğerleri, 2021 ).

Diferansiyel ultra santrifüjleme, bakteriler, organeller ve ekzosomlar gibi mikroskobik parçacıkları etkili bir şekilde izole edebilen ekzosom izolasyonu için "altın standart" yöntem olarak kabul edilir ( Ter-Ovanesyan vd., 2021 ). Tamm-Horsfall protein polimerinin idrar ekstraselüler veziküllerinin verimi ve saflığı üzerindeki etkisini en aza indirmek için diferansiyel ultra santrifüjleme, yaygın protein kontaminasyonlarını azaltmak için Tamm-Horsfall protein polimer indirgemesini ve alkali yıkamayı birleştirir ( Correll vd., 2022 ). Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ( Langevin vd., 2019 ), ekstraselüler bileşenleri (ekzosomlar, apoptotik veziküller ve protein agregatları gibi) izole etmek için kullanılabilen katmana yüksek yoğunluklu ortam (sükroz veya iyodiksanol vb.) eklendiğinden zaman alıcı bir yöntemdir. Tek adımlı sakaroz yastık ultra santrifüjasyonu, MSC'lerden türetilen ekzosomların ekstraksiyonunu elde etmek için kullanılabilir ( Gupta ve ark., 2018 ). Li ve ark. (2018) ve Luo ve ark. (2021), ekzosom hasarını en aza indirirken ekzosomların geri kazanımını ve saflığını en üst düzeye çıkarmak için bu yöntemi geliştirdiler. Sakaroz bazlı gradyan santrifüjlemenin aksine, hücre dışı veziküllerin alt popülasyonlarının izolasyonu, yüksek çözünürlüklü iyodiksanol yoğunluk gradyan santrifüjlemesiyle daha verimli bir şekilde gerçekleştirilebilir ( D'Acunzo ve ark., 2022 ).

İzolasyon saflığını artırmak için araştırmacılar, ekzosomların izolasyonu için ultra santrifüjleme ve ultra filtrasyonu boyut dışlama kromatografisiyle birleştirmeyi denediler ( Guan ve ark., 2020 ; Shu ve ark., 2021 ; Turner ve ark., 2022 ). Çalışmalar, boyut dışlama kromatografisiyle birlikte ultra filtrasyonun izole edilmiş ekzosomlarda safsızlık sitokin (interlökin-10) seviyesini azaltabileceğini göstermiştir. Çeşitli yöntemlerin birleşimi, nanometre ölçeğindeki kirleticilerin varlığını etkili bir şekilde azaltabilir, ayırma saflığını artırabilirken ekzosomların doğal özelliklerini koruyabilir. Yöntem birleşimine ek olarak, diğer araştırmacılar ekzosom izolasyonu için dikotomik boyut dışlama kromatografisini önerdiler ve CL-6B 20 mL kolonunun daha yüksek izolasyon verimi ve daha sıkı EV tepe noktalarıyla en iyi performansa sahip olduğunu buldular (şekil 2) ( Guo vd., 2021a ). Günümüzde, piyasada qEV boyut dışlama kolonları mevcuttur. Moleküler parçacık boyut segmentasyonu ilkesine dayanarak, 15 dakika içinde çok çeşitli numunelerden yüksek aktiviteli ekzosomlar çıkarılabilir ( Cardoso vd., 2021 ). Ayrıca, çalışmalar teğetsel akış filtrasyonunun geleneksel çıkmaz filtrasyondan ziyade ultrafiltrasyon işlemleri için daha uygun olduğunu göstermiştir ( Han vd., 2021b ; Kim vd., 2021 ). Teğetsel akış filtrasyonunda, olası tıkanma etkili bir şekilde azaltılabilir ve paralel akış dinamiklerinin etkisi altında kapsamlı filtrasyon sağlanabilir. Çökelti bazlı ve immünoafinite bazlı kitler, ekzosom izolasyonu için yaygın olarak kullanılmıştır ( Kamei vd., 2021 ; Mondal ve Whiteside, 2021 ). Dahası, polisakkarit kitosan küçük ekstraselüler veziküllerin izolasyonunu kolaylaştırabilir ( Kumar vd., 2021 ). Ve araştırmacılar ( Crescitelli vd., 2021 ), dokulardan EV alt popülasyonlarını izole etme ve karakterize etme sürecini özetlediler.

ŞEKİL 2

İkili SEC'in kurulması. 2 toplu elüsyon adımıyla ikili SEC ayrımı, ekstraselüler vezikülün izolasyonu için yeterliydi. Paketleme malzemesi CL-6B ve yatak hacmi 20 mL olduğunda, en iyi ayırma performansı olacaktır. ( Guo ve diğerleri, 2021a ) izniyle yeniden üretilmiştir.

Git:

Ekzosom izolasyonu için 3 yeni yöntem

Ultra santrifüjleme ve kit ekstraksiyonu gibi ekzosomların geleneksel izolasyon yöntemleri bilimsel araştırmalar için yaygın olarak kullanılsa da, bu yöntemlerin düşük izolasyon verimi ve saflığı, zaman alıcı olması gibi belirli sınırlamaları vardır. Ekzosomların klinik uygulamalarda (hasta başı testi, POCT gibi) uygulanması ciddi şekilde engellenmektedir. Son yıllarda, mikroakışkan çiplerin geliştirilmesiyle ( Lu ve ark., 2022 ), mikro plakalarda ve mikrokanallarda küçük hacimli sıvıları işlemek veya manipüle etmek mümkün hale gelmiştir. Mikroakışkan cihazlar, bir mikroçip üzerinde izolasyon ve tanımlamanın bütünleşmesini sağlamak için kullanılır ( Ullah Khan ve ark., 2021 ). Ek olarak, ekzosom izolasyon tekniklerinin geliştirilmesinin çok yönlü referansı, nanomalzemeler, immünomanyetik boncuklar ve kovalent kimya uygulamalarıyla sağlanabilir. Bunlar, izolasyon verimini ve saflığını iyileştirmede ve ekzosomların biyoaktivitesini korumada önemli rol oynarlar. Her yöntemin prensipleri, avantajları ve dezavantajları aşağıda özetlenmiştirTablo 2.

3.1 Entegre mikroakışkan

Mikroakışkan teknolojisi, mikro gözeneklerdeki minik sıvıların manipülasyonu ve işlenmesini ifade eder. Eksozomların tek adımlı bir işlemde izolasyonu ve karakterizasyonu, çip tabanlı mikroakışkan sistemleri geliştirmek için mikrofabrikasyon teknolojileriyle sağlanır. İmmünoafinite yakalama ( Mondal ve Whiteside, 2021 ), boyut dışlama kromatografisi (μSEC) ( Leong ve ark., 2022 ) ve ultra santrifüjasyona ( Kang ve ark., 2021 ) dayalı kapsamlı mikroakışkan cihazlar, eksozomların etkili bir şekilde izolasyonu için geliştirilmiştir. Mikroakışkan cihazlar ve sinyal algılama platformlarının birleşimi ile eksozomların çok küçük hacimli biyoakışkanlardan hızlı bir şekilde izole edilmesi, gerçek zamanlı karakterizasyon ve eksozomların yerinde tanısı gerçekleştirilebilir. İnvaziv olmayan hastalık tespiti için önemlidir. Mikroakışkanların avantajları kolaylık, yüksek verimlilik, otomasyon kolaylığı, entegrasyon ve taşınabilirliktir. Ancak, numune parmak ucu hacminde beslendiği için numune verimi düşüktür. Mikroakışkan cihazlar ayrıca ekzosomların izolasyonu ve tanımlanması için miRNA'ların üstel izotermal amplifikasyonu (EXPAR) ile birleştirilebilir ( Qian ve ark., 2022 ). Bu arada, tek hücreli bir yakalama çipi ve mekansal olarak kodlanmış bir antikor barkod çipinden oluşan entegre mikroakışkan platformlar da tek hücreli heterojenliği keşfetmek için kullanılabilir ( Song ve ark., 2022 ).

3.1.1 Asimetrik akış alan akış fraksiyonasyonu

Alan akış fraksiyonlaması, makromolekülleri izole etmek için kullanılabilir ( Manning vd., 2021 ). Düz bir kanaldan geçen moleküller hem yatay hem de dikey akış alanlarına tabi tutulur. Düz kanal üstten kapalı ve sadece alttan açık olduğunda Asimetrik Akış Alanı-Akış Fraksiyonlaması (AF4) olarak adlandırılır. AF4, esas olarak nanoölçekli çözünür parçacıkları izole etmek için boyuta dayanmaktadır ( Wu vd., 2020 ). Parçacık boyutu ve difüzyon katsayısı arasında yüksek bir korelasyon vardır ( Zhang ve Lyden, 2019 ). Parçacıkların izolasyonu difüzyon katsayısından etkilenebilir, bu nedenle AF4 izolasyonunun anahtarı parçacık boyutudur. AF4'ün tabanı, belirli boyuta sahip yarı geçirgen bir zardır. Kesme boyutundan daha küçük boyutlara sahip moleküller yarı geçirgen zardan geçebilir ve kesme boyutundan daha büyük bileşenler tutulur. Yapılan çalışmalar AF4'ün nanometre ölçeğinden mikrometre ölçeğine kadar parçacıkları tanımlayabildiğini, geniş dinamik aralığa ve yüksek çözünürlüğe sahip olduğunu, 1 nm'ye kadar çözünürlük sağladığını göstermiştir ( Marioli vd., 2019 ).

Diğer izolasyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, AF4 etiketleme veya manyetik boncuk içermez ve yüksek bir tekrarlanabilirliğe sahiptir. Ancak, AF4 yalnızca küçük hacimli numuneleri işlemek için kullanılabilir ve aynı boyutta ve farklı morfolojiye sahip parçacıkları taramak için kullanılamaz. Karmaşık üretim süreci, klinik uygulamalar için bir engeldir ( Berger ve ark., 2021 ). Dahası, asimetrik derinlik filtrasyonu (DF), gözenekli ortamın yüzeyinde ve derinliğinde hücre dışı vezikülleri hareketsizleştirerek ve ardından filtreden geçen taşıyıcı akışı tersine çevirerek bunları geri kazanarak hücre dışı vezikülleri izole edebilir. Optimize edilmiş üç adımlı izolasyon prosedürüyle karşılaştırıldığında, DF plazma hücre dışı veziküllerinin ayrılması için daha uygundur ( Chernyshev ve ark., 2022 ).

3.1.2 Deterministik yanal yer değiştirme

Deterministik Yanal Yer Değiştirme (DLD), parçacık boyutuna dayalı izolasyondur ve ekzosomların izolasyonu için kullanılabilir ( Hochstetter vd., 2020 ). Sistem, mikrokolonlar arasındaki boşlukların ve ofsetlerin geçebilen parçacıkların çapını belirlediği düzenli bir mikrokolon dizisinden oluşur. DLD'deki tırtıklı ve yer değiştirmiş modlar arasındaki kesme boyutu parametresine DLD kritik çapı (Dc) denir ve esas olarak kolon şekli, kolon boşluğu ve dizi gradyanı tarafından belirlenir ( Ho vd., 2020 ). Biyosıvılar diziden akar. Parçacık boyutu kritik boyuttan daha küçük olduğunda, parçacıklar dizi boşluğu boyunca ilk akım çizgisini takip edecektir. Parçacık boyutu kritik boyuttan daha büyük olduğunda, parçacıklar çapraz düzenli bir akış hattında kolon darbesiyle yanal olarak yer değiştirir. Sürekli akış kolon dizisi gradyanı sayesinde, DLD bakteri, virüs ve maya izolasyonu için yaygın olarak kullanılır.

Ancak, mikron veya hatta nanoölçekte yer alan akışkan dinamikleri nedeniyle, üretim ve ayırma işlemi daha zordur. Smith ve arkadaşları (2018), geleneksel dizilere kıyasla ∼900 μL/saatlik yükseltilmiş bir akışkan akış hızına sahip bir nanoDLD çipinde iyileştirme yaptı. Daha 2016 yılında, Zeming KK ve arkadaşları, nanoparçacıkların izolasyonu için, esas olarak nanoyapılar ve parçacıklar arasındaki etkileşimi düzenlemek için tuz iyonlarının konsantrasyonunu değiştirerek bir DLD cihazı tasarladılar. Bir dereceye kadar, ekzosomların biyoaktivitesi ve morfolojik bütünlüğü korunabilir. Ek olarak, ekzosomlar DLD ile yüksek ayırma verimi ve düşük tüketimle ve etiketleme olmadan izole edilebilir. Ancak, çip geleneksel izolasyon yöntemlerine göre tıkanmaya daha yatkındır ve bu da daha düşük izolasyon saflığıyla sonuçlanır.

3.1.3 Dielektroforetik izolasyon

Dielektroforetik izolasyon (DEP), pozitif ve negatif dielektroforez dahil olmak üzere, homojen olmayan bir elektrik alanında dielektrik polarizasyona tabi tutulan nötr parçacıkların öteleme hareketine dayanır. Daha küçük parçacıklar mikroelektrotların kenarları etrafındaki DEP yüksek alan bölgesine girerken, daha büyük parçacıklar elektrotlar arasındaki DEP düşük alan bölgesine girer. Homojen olmayan simetrik bir elektrik alanında, parçacıklar her iki tarafta farklı yerel elektrik alan güçlerine maruz kalır ve elektrostatik bir kuvvet, yani dielektrik elektroforetik kuvvet üretir. Dielektrik elektroforetik kuvvet, askıdaki parçacıkların boyutu, dielektrik sabiti ve elektrik alan şiddeti tarafından belirlenir. Askıdaki parçacıklar ve ortam farklı dielektrik sabitlerine sahip olduğundan, parçacıklar daha güçlü veya daha zayıf bir elektrik alanına doğru hareket edecektir. Diğer ayırma yöntemleriyle karşılaştırıldığında, DEP ekzosomların hızlı ayrılması için daha seçici ve kontrol edilebilirdir ve etiketleme yoktur ( Tayebi ve diğerleri, 2021 ; Zhang ve diğerleri, 2022a ).

DEP'in izolasyon etkinliğini genişletmek için Ayala-Mar ve arkadaşları (2019) DC yalıtkan bazlı dielektroforez (DC-iDEP) önerdiler. iDEP, parçacıkları boyuta göre izole edebilen bir DEP çeşididir. Çipe elektrot yerleştirilmesi gerekmediğinden, üretim süreci büyük ölçüde basitleştirilmiştir ( Shi ve arkadaşları, 2018 ). Araştırmacılar, iki elektriksel olarak yalıtılmış kolon fraksiyonu kanalından oluşan bir mikro cihaz tasarladılar ve ekzosomların izolasyon verimliliği, DC-iDEP'te geri kazanılan fraksiyonun parçacık boyutunu analiz ederek değerlendirilebilir. iDEP, ekzosomları verimli bir şekilde yakalayabilse ve ekzosomların alt popülasyonlarını bir dereceye kadar ayırt edebilse de, izolasyon saflığının düşük olduğu ve cihazın aşırı ısınmaya maruz kaldığı yadsınamaz. Zhao ve arkadaşları. (2021), çatallı parmak DEP elektrotları ile DEP haznesinde çok sayıda mikro kuyu içeren ve tek polistiren (PS) mikro kürenin mikro gözeneklerde hareketsizleştirildiği bir ExoDEP-çip mikroakışkan cihazı önerdi. Ekzosom yakalama, PS yüzeyindeki önceden konjuge edilmiş antikorlar tarafından elde edilir. ExoDEP-çip, ekipman ve operasyon açısından daha esnek ve daha az karmaşıktır.

Ek olarak, negatif manyetoelektroforeze dayalı hücre kültürü üst sıvılarından küçük ekstraselüler vezikülleri (sEV'ler) çıkarmak için kullanılabilen etiketsiz bir manyetik izolasyon sistemi sunuldu ( Zeng ve ark., 2022 ). Mikrokanal içindeki güçlü manyetik alan Dört NdFeB mıknatıs (N52) tarafından üretilir. Parçacıklar kılıf akışı ile izolasyon kanalında yoğunlaştırılır ve güçlü manyetik kuvvetle manyetik kutup dizisi tarafından izolasyon kanalının merkezine itilir, farklı boyutlardaki parçacıklar farklı çıkışlarda ayrılır. Diğer izolasyon yöntemlerine kıyasla %85,80'e kadar geri kazanım ve %80,45'e kadar ayırma saflığına sahip biyouyumlu ferromanyetik sıvılar kullanılarak daha yüksek geri kazanım ve saflık elde edilebilir. Negatif manyetoelektroforez ile sEV'lerin izolasyonu manyetik çözeltide gerçekleştirildiğinden, sEV'lerin biyoaktivitesini etkilemesi muhtemel olduğundan, manyetik çözeltiye oldukça ihtiyaç duyulmaktadır.

3.1.4 Akustik fraksiyonlama

Akustik Fraksiyonlama, parçacıkları boyut ve yoğunluğa göre izole edebilir ( Wang ve ark., 2021 ). Parçacıklar mikro kanalda akustik duran dalgalara (SAW) tabi tutulur. Akustik radyasyon kuvveti ve Stokes direnci üretilebilir. Daha büyük parçacıklar için akustik radyasyon kuvveti baskındır ve daha küçük parçacıklar için Stokes direnci baskındır. Akustik fraksiyonlama etiketleme gerektirmez ve kullanımı kolaydır. İlgili çalışmalar, ekzosomların %98'e kadar saflıkta ve %82'ye kadar ayırma oranında biyosıvılardan ayrılabileceğini göstermiştir. Wu ve ark. (2017), ekzosomları doğrudan kan örneklerinden izole edebilen tek bir çipe entegre edilmiş bir akustik akış kontrol platformu tasarladılar. Tükürük ekzosomları cihaz tarafından doğrudan izole edilebilir (Figür 3) ( Wang ve diğerleri, 2020 ). Ancak, klinik uygulaması özel enstrümantasyona duyulan ihtiyaçla sınırlıdır. Tek vezikül tekniğinin geliştirilmesiyle birlikte araştırmacılar, tek vezikül tekniğinin atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ve ultra hassas TiN-NH-lokalize yüzey plazmon rezonans (LSPR) biyosensörleri ile birleştirilmesinin, in vivo sıvı biyopsi için ekzosom ilişkili proteinleri karakterize etmek ve ölçmek için kullanılabileceğini öne sürdüler ( Silva ve diğerleri, 2021 ; Thakur ve diğerleri, 2021 ).

FİGÜR 3

Tükürük ekzom izolasyonu için akustik sıvı cihazının şematik diyagramı. Mikrometre ve alt mikrometre atıkları 20 MHz ve 40 MHz yüzey ses dalgaları kullanılarak ayrılabilir. Ayırma işlemi sırasında parçacıklar akustik radyasyon kuvvetine ve sürükleme kuvvetine maruz kalır. Ekzomlar ikinci ayırma modülünde ayrılabilir. ( Wang ve diğerleri, 2020 ) izniyle yeniden üretilmiştir.

Akustik fraksiyonlamaya ek olarak, ferrohidrodinamik ve mikroakışkan sistemleri birleştiren bir FerroChip cihazı, hücre dışı vezikülleri izole etmek için önerilmiştir ( Liu vd., 2020 ). Ferromanyetik sıvı kılıf akışının etkisi altında, antimanyetik nanopartiküllerin ve hücre dışı veziküllerin ferromanyetik sıvı ile ön karışımları düz mikrokanallara girer. Küçük parçacıkların, parçacık boyutundaki fark nedeniyle daha yavaş bir oranda göç etmesine izin verilirken, hücre dışı veziküller daha hızlı bir oranda göç eder ve bu da kanal çıkışında mekansal izolasyonla sonuçlanır. Mikroakışkan çipte etiketleme yoktur ve hücre dışı veziküller sürekli akış ve boyuta bağlı bir şekilde yakalanacaktır. %94,3 geri kazanım ve %87,9 izolasyon saflığı elde ettiği bildirilmiştir.

3.1.5 Temassız mikroakışkanlar

Temassız mikroakışkanların ayırma prensibi, elektrikli aracı içeren akışkanın viskoelastik ortam akışına dayalı bir mikroakışkan sistemde mikrokanal duvarı boyunca bir kılıf akışıyla karşılaşmasıdır ( Rodriguez-Quijada ve Dahl, 2021 ). Akışkanların viskoelastisitesi tarafından üretilen elastik kaldırma kuvveti uygulandıktan sonra ekzosomlar ve diğer hücre dışı bileşenler, boyutlarına göre mikrokanalın merkez hattına doğru sürülür. Daha büyük parçacıklar sonunda merkez hattına ulaşır ve böylece ekzosomların izolasyonu sağlanır. Ayrıca araştırmacılar, hücre dışı veziküllerin mikroakışkan çiplerdeki fosfolipitler ve transmembran proteinler tarafından hızla zenginleştirilebileceğini ve tespit edilebileceğini belirtmişlerdir ( Ren vd., 2022 ). Li vd. (2022), farelerde prostat kanseri (PCa) evrelemesi ve klinik PCa hastalarının erken tespiti için uygulanan bir 3D-SiO2 gözenekli çip önermiştir . Sonuçlar, klinik hastaların erken tespit oranının temassız mikroakışkanlar ile iyileştirilebileceğini göstermektedir. Nanometre ölçeğindeki gözenekli özellikler ekzosom-spesifik belirteçlerle birleştirildiğinde, 3D- SiO2 gözenekli çip ile biyosensör hassasiyeti önemli ölçüde artırılabilir .

3.1.6 Diğer yaklaşımlar

3.1.6.1 Ultra hızlı ekzom izolasyon sistemi ile yakalama

Chen vd. (2021), ekzosomların verimli izolasyonu ve tespiti için ultra hızlı bir ekzosom izolasyon sistemi (EXODUS) önermiştir. EXODUS, farklı biyosıvılardan ekzosomların otomatik olarak saflaştırılmasına olanak tanır. Önemli kısım, negatif basınç salınımları ve çift bağlı rezonatörler tarafından üretilen membran titreşimleriyle ekzosomların izole edilmesidir. Membran üzerinde çift frekanslı enine dalgalar üretilir. Nanogözenekli membranlar ve kartuş salınımları, tıkanıklıksız ve ultra hızlı ekzosom saflaştırması elde etmek için membran kirlenme etkilerini bastırmak için kullanılır. Sistemde, her ikisi de nanogözenekli anodik alüminyum oksit membranlara bağlı olan bir sol ve sağ çıkışlı çift filtreli bir küvet bulunur ( Patel vd., 2020 ). Negatif basınç ve hava basıncının yönü değiştirilerek, anodik alüminyum oksit membranlar boyunca periyodik negatif basınç salınımları üretilir. Ekzosomlar merkezi bölmede tutulurken küçük parçacıkların ve sıvıların geçişine izin vermek için negatif basıncın periyodik olarak değiştirilmesi kullanılır. Nanopore disk rezonatörü tarafından üretilen yüksek frekanslı harmonik salınımlar ve cihaz boyunca kullanılan düşük frekanslı harmonik salınımlar ile çift frekanslı enine dalgalar ve akustik sıvı yüzey parçacıklarını yeniden askıya alarak parçacık kümelenmesini ve ölçekleme etkilerini etkili bir şekilde bastırır (Şekil 4). EXODUS'un fonksiyonel doğrulaması için 113 klinik idrar örneği aldılar.

ŞEKİL 4

NPO mekanizması ve EXODUS cihazının şematik diyagramı. Ekzosomlar negatif basınç salınımları ve çift bağlı harmonik osilatör membran titreşimleri kullanılarak ultra hızlı bir şekilde izole edilebilir. ( Chen ve diğerleri, 2021 ) izniyle yeniden üretilmiştir.

Çöktürme ve ultra santrifüjleme gibi geleneksel izolasyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında EXODUS, izolasyon hızı, verim ve saflık açısından avantajlara sahiptir. Dahası, numunelerin işlenme süresi kısadır ve 10 mL idrar için 10 dakikaya kadar daralmaktadır. Eksozomların saflığı üromodulin ile doğrulanmıştır ( Droste vd., 2021 ). Çöktürme ve membran afinitesi ile karşılaştırıldığında, üromodulinin bant yoğunluğu daha düşüktü ve bu da EXODUS'un iyi saflaştırma performansını göstermektedir. EXODUS ile 15 mL hücre kültürü ortamının saflaştırılması, protein safsızlıklarının yaklaşık %99'unun giderilmesi ve eksozomların yaklaşık %90'ının geri kazanılmasıyla sonuçlanmıştır. iTEARS, EXODUS'u kullanarak küçük hacimli gözyaşlarından (∼10 µL) eksozomları hızla izole edebilir ( Hu vd., 2022 ). Bu sistem, gözyaşı eksozomlarına dayalı hassas tıbbın kurulması için önemli sonuçlara sahiptir.

3.1.6.2 Santrifüjlü mikroakışkan disk sistemi ile yakalama

Santrifüjlü mikroakışkan disk sistemi (Exo-CMDS), ekzosomların izolasyonu için Zhao ve arkadaşları (2022) tarafından önerilmiştir. Otomatik santrifüjlü mikroakışkan disk sistemi, Exo-CMDS'yi oluşturmak için işlevselleştirilmiş bir membranla birleştirilir. Santrifüjlü mikroakışkan disk, biri kan hücrelerini ve daha büyük parçacıkları filtrelemek için kullanılan ve diğeri ekzosomları zenginleştirmek için kullanılan iki işlevsel membran içerir. Membran, ekzosom yüzeyinden negatif yükü adsorbe eden pozitif yüklü kuaternize rejenere selüloz membrandır. Bu sistemde, ekzosomlar yükleme tamponu (ExoL) tarafından membrana adsorbe edilebilir ve membrandaki ekzosomlar ayırma tamponu (ExoI) tarafından elüe edilebilir. Exo-CMDS'nin geleneksel izolasyon yöntemlerine göre avantajları daha yüksek izolasyon verimi ve saflığıdır. Ek olarak, Exo-CMDS daha yüksek duyarlılığa, daha yüksek özgüllüğe ve düşük maliyete sahiptir. 300 μL'den az hacimli kan örneklerini işlemek sadece 8 dakika sürdü. Aynı zamanda, yeni aptamer floresan sistemi (Exo-AFS), kanser teşhisinde yararlı olan ekzosomal yüzey proteinlerini tespit etmek için Exo-CMDS ile birleştirilebilir. Dahası, damlacık tabanlı hücre dışı vezikül analizi (DEVA) ( Yang ve diğerleri, 2022a ) ile belirli alt popülasyonların kantifikasyonuna izin verilir. Bu platformda, damlacık oluşturma, işleme ve analiz aynı anda gerçekleştirilebilir ve hücre dışı veziküllerin yüksek verimli dijital belirlenmesine olanak tanır.

3.1.6.3 3D ZnO nanodizileri ile yakalama

Hao vd. (2020) akustofluidik teknolojiyi kullanarak çok işlevli bir 3B nanoyapılı dizi sundu. Akustik sensör, nanoölçekli biyomolekülleri yakalayabilen bir kılcal mikrokanal içinde 3B ZnO nanodizisi oluşturmak için bir akustofluidik reaktörle entegre edildi. ZnO nanodizisi uzunluk, yoğunluk ve çap açısından geniş bir elastik aralığa sahiptir. Aynı zamanda, eksozomlar, DNA, oligonükleotidlerin tespiti için ZnO-Ag kılcal elemanlar elde etmek üzere Ag nanopartikülleri ZnO nanodizilerine biriktirildi. ZnO-Ag kılcal damarlarının işlevsel doğrulaması sonlu fark zaman alanı (FDTD) simülasyonları ile gerçekleştirildi. Mikroanalitik cihazların geliştirilmesi fikirleri, ZnO-Ag'nin geliştirilmiş optik algılamasıyla sağlanabilir. Zhang vd. (2019) eksozomların analizi için entegre bir platform geliştirdi (ExoProfile çipi). 3 boyutlu gözenekli serpantin nanoyapılar yenilikçi bir şekilde inşa edildi ve bu çip ile ekzosomların çoklu tespiti mümkün oldu. Ek olarak, çift seçici floresan nanosensörün ( Feng ve ark., 2022 ), Janus tel kafes DNA küpüne dayalı 3 boyutlu nanomakinenin ( Xu ve ark., 2022 ) ve kübik DNA nanouzaylarına dayalı 3 boyutlu moleküler işaretin ( Mao ve ark., 2022 ) ekzosomların karakterizasyonu ve analizi için kullanılabileceği gösterildi ( Guo ve ark., 2021b ).

3.2 Çip üzerinde immüno-yakalama

Eksozom izolasyonu için immünolojik yöntemler esas olarak eksozomların yüzeyindeki karakteristik proteinleri (CD63, CD9 ve ısı şoku proteinleri gibi) modifiye edilmiş antikorlar veya aptamerler tarafından yakalamaktır. Biyotinlenmiş antikorlar veya aptamerler ve immünomanyetik boncuklar eksozom izolasyonu için kullanılabilir. Fonksiyonelleştirilmiş manyetik boncuklar, mikroakışkan cihazları immünolojik yöntemlerle birleştirerek eksozom izolasyonu için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu arada, eksozom izolasyonu ve tespitinin entegrasyonu yöntemlerin birleştirilmesiyle gerçekleştirilebilir. Örneğin, Zhang ve ark. (2022b) kanser tanısı ve tedavisi için etkili bilgi sağlamak amacıyla yüzey plazmon rezonans biyoçipi (SPR-ExoPD-L1) temelinde eksozomlarda PD-L1'in etiketsiz tespitini gerçekleştirmiştir. MoS2-AuNS'lerin yüzeyine özel olarak CD63'e bağlanmış bir floresan biyosensör ( Chen vd., 2022 ) veya bir ROX etiketli aptamer (ROX-Apt), ekzosomları tespit etmek için kullanılabilir ( Pan vd., 2022 ).

3.2.1 Lipid mikrodizileri

Lipid mikrodizi, ekzosom yakalama için yeni bir stratejidir. Mikrodiziler, ekzosomların yüzeyindeki karakteristik proteinleri tanıyabilen spesifik antikorları taşıyabilir. Daldırma kalem nanolitografisi ile birlikte, hücre dışı veziküllerin (EV'ler) oldukça seçici bir şekilde yakalanmasına izin verilir. Liu ve arkadaşları (2021), çeşitli substratlar üzerinde lipid yamalarının mikron veya nanoskala desenlerini oluşturmak için lipid daldırma kalem nanolitografisini (L-DPN) kullandılar. Biyotinlenmiş fosfolipid başlık biyotinilinin %5 mol oranında karıştırıldığı DOPC'nin ( Fox ve arkadaşları, 2021 ) lipid membranları, daha sonra biyotinlenmiş antikorlar için bağlanma yerleri sağlamak üzere streptavidin çözeltisi ile inkübe edilen L-DPN yoluyla elde edilir. Hedef EV'ler, EV'ler diziden geçerken yakalanabilir. EV kargoları sonunda membran füzyonu yoluyla membran yamasında yakalanır (Şekil 5). Sadece küçük bir sıvı hacmiyle son derece hassas bir kurtarma, lipit mikrodizileri ile elde edilebilir. Aynı zamanda, mikrodizi doğal olarak kirlenme önleyici özelliklere sahiptir ve akış aşağısı genomik ve proteomik analiz için bir temel sağlar. EV'leri görselleştirmek için, EV'ler lipofilik boya boyama (örneğin, PKH26) kullanılarak floresan mikroskopisi altında açıkça gözlemlenebilir. Lipit mikrodizi platformu, çeşitli kontroller/deneyler tarafından doğrulanan MCF7 hücre şartlandırılmış ortamından EV'leri etkili bir şekilde yakalayabilir. Ayrıca, işlevsel EV'ler anyon değişim yöntemi ile taranabilir ( Seo ve diğerleri, 2022 ). Ancak, bu mikrodizi biyolojik olarak aktif ekzosomların büyük ölçekli izolasyonu için uygundur.

ŞEKİL 5

Destekleyici lipit zarları (SLM) tarafından yakalanan ekstraselüler veziküllerin şeması. (A) Biyotinlenmiş SLM dizilerinin üretimi L-DPN ile gerçekleştirilebilir. (B) Biyotinlenmiş SLM dizileri streptavidin ile kapsüllenir. (C) Biyotinlenmiş antikorlar, belirli EV'leri yakalamak için SLM dizilerine bağlanabilir. (D) Kanserle ilişkili EV'ler SLM dizilerinde yakalanır. (E) EV'nin SLM ile füzyonu. (F) EV biyomalzemelerinin (RNA, proteinler gibi) yakalanması. ( Liu ve ark., 2021 ) izniyle yeniden üretilmiştir .

3.2.2 İmmunomanyetik boncuklarla yakalama

Sıvı biyopsi çipleri, ekzosomların izolasyonu ve tanımlanmasının entegrasyonu için giderek ana akım haline geliyor. Bathini S ve arkadaşları, sentetik peptit Vn96'yı kullanarak EV'leri izole etmek için manyetik parçacık tabanlı bir çip önerdiler ( Bathini ve arkadaşları, 2021 ). Vn96, EV'lerin yüzeyinde ifade edilen ısı şoku proteinine (HSP) bağlanabilir ( Taylor ve arkadaşları, 2020 ; Roy ve arkadaşları, 2021 ). Çipte bir 3 boyutlu karıştırıcı ve bir sedimantasyon ünitesi bulunmaktadır. Streptavidin kaplı manyetik parçacıklar, Vn96'ya bağlı manyetik parçacıklar haline gelmek için 30 dakika boyunca bir santrifüj tüpünde Biotin-PEG-Vn96 ile birlikte inkübe edildi ve ardından şırıngalara toplandı. Eşit miktarda Vn96'ya bağlı manyetik parçacık, aynı akış hızında MCF7 CCM ile eş zamanlı olarak sıvı biyopsi çipine enjekte edildi. Haznenin içinde tamamen bağlı olan parçacıklar haznenin başlangıcından itibaren 0,5 mm içinde çökmeye başlar. Çökelti sonunda toplanır (Şekil 6). Daha sonra EV'ler elüe edilir ve karakterize edilir, housekeeping geninin kantifikasyonu için damlacık dijital PCR ile birleştirilir ( Pan ve ark., 2020 ). EV'lerin biyoaktivitesi ve morfolojik yapısı çip tarafından korunabilir. Lipid mikrodizisine benzer şekilde, hastalıkların erken teşhisi için kullanılabilir. Ek olarak, Park ve ark. (2021), klinik yüksek verimli EV analizinde kullanılabilen 96 kuyulu bir analiz olan yüksek verimli entegre bir manyeto-elektrokimyasal cihaz (HiMEX) önermiştir. Bu analiz, EV'leri antikor kaplı manyetik boncuklarla zenginleştirebildi ve enzim amplifikasyonundan sonra elektrokimyasal tespit yoluyla EV'lere bağlı proteinleri kantitatif olarak belirleyebildi.

MCF7 CCM'den EV izolasyonunun şeması. Vn96'ya bağlı manyetik parçacıklar, EV izolasyonu için aynı akış hızında MCF7 CCM ile aynı anda sıvı biyopsi çipine enjekte edilir. EV'ler sedimantasyon ünitesindeki manyetik parçacıklar tarafından yakalanır. ( Bathini ve diğerleri, 2021 ) izniyle yeniden üretilmiştir.

Yu ve arkadaşları (2021) tarafından önerilen son derece entegre Ekzom Ayırma ve Tespit (ExoSD) çipi, ekzosomları hücre kültürü üst sıvılarından sürekli akış şeklinde çıkarmak ve ardından ekzosomların immünofloresansla tespitini yapmak için kullanılır. ExoSD çipi bir ayırma bölgesi ve bir tespit bölgesi içerir. Hücre kültürü üst sıvısındaki ekzosomlar immünomanyetik nanopartiküller (IMNP'ler) tarafından yakalandı. Karışım ExoSD çipine enjekte edildi. Ekzosomlar@IMNP'ler karışımdan ayırma bölgesinde ayrılacaktır. Ayrılan Ekzosomlar@IMNP'ler tespit bölgesine akıtıldı ve Ni silindir dizisi üzerinde yakalandı. Nikel (Ni) tarak benzeri yapı, IMNP'ler üzerindeki manyetik kuvveti artırmak için kullanıldı. Son olarak, kanser hücresinden türetilen ekzosomlar floresan antikorlarla etiketlenecektir (Şekil 7). ExoSD çipi, ekzosom izolasyonu ve tespiti için giderek çok işlevli bir platform haline geldi. Ekzosomların geri kazanımı %80'den fazlaydı ve saflık 4,8 mL/saatlik enjeksiyon frekansında %83'ten fazlaydı. Ekzosomlar, plazmaya bağlı elektrokemilüminesans immünosensörler ( Xiong ve diğerleri, 2022 ) tarafından tespit edilebilir.

IMNP'ler tarafından ekzosom ayrımı için ExoSD çipi. Ayrılan ekzosomlar@IMNP'ler Ni silindir dizisi üzerinde yakalandı ve tespit için floresan antikorlarla etiketlendi. (A) Yerel manyetik alan ve manyetik alan gradyanı geliştirme için Ni tarak benzeri yapının şeması. (B) Mikrofiltrenin SEM görüntüsü. (C) Ni silindir dizisi tarafından ekzosomların@IMNP'lerin yakalanmasının şematik diyagramı. (D) ExoSD çipinin üç boyutlu diyagramı. ( Yu ve diğerleri, 2021 ) izniyle yeniden üretilmiştir .

Cheng ve ark. (2022) immünomanyetik kirpi parçacıkları (IMHP) adı verilen ekzosomların izolasyonu ve salınımı için bir sistem önerdiler. TiO2 demetleri, hidrotermal bir yöntem kullanılarak belirli sivri uçlara sahip kirpi tipi TiO2 parçacıklarına (TiO2 HP) monte edildi. Daha sonra redoks tepkili disülfür bağları ve CD63 antikorları içeren manyetik tepkili nanopartiküller Fe3O4, TiO2 HP'ler üzerinde immobilize edilerek TiO2 @ Fe3O4 -anti - CD63HP'ler ( IMHP'ler) elde edildi . MCF -7 hücrelerinden IMHP'ler tarafından izole edilen ekzosomların yakalama verimliliği %91,70'e kadar çıktı. Ekzosomlar, %82,45'e kadar salınım verimliliğiyle Tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP) ile IMHP'ler üzerindeki disülfür bağlarının indirgenmesiyle salındı. Yüksek izolasyon verimliliğine ek olarak, ekzosomların biyoaktivitesi ve yapısal bütünlüğü, geleneksel izolasyon yöntemlerine kıyasla IMHP'ler tarafından korunabilir. Ekzosom izolasyonu için ön işlem adımlarını azaltmak amacıyla Boriachek K ve arkadaşları, ekzosomları doğrudan izole etmek için CD63 antikorları işlevselleştirilmiş altın yüklü demir oksit nanoküpleri (Au-NPFe 2 O 3 NC) kullandılar ( Boriachek ve arkadaşları, 2019 ).

Hızlı izolasyon için 3D Kağıt Tabanlı sEV izolasyon sistemi (sEV-IsoPD) kullanılır ve yüksek verim ve saflık avantajları sağlanabilir ( Zhang ve diğerleri, 2022c ). sEV-IsoPD, bir peristaltik pompa, bir filtre tutucu ve dört hücre kabından oluşur. Filtre tutucu, boyut dışlama için bir polikarbonat gözenekli membrandan ve metal-organik çerçeve (MOF)/CD63 antikoru modifiye edilmiş kağıttan (Ab@MOF@paper) oluşur. EV'ler, Ab@MOF@paper ile serumdan ve hücre kültürü ortamından izole edilebilir. Ab@MOF@paper tarafından yakalandıktan sonra, sEV'ler ZIF-90'dan glutatyonun katabolize edilmesiyle serbest bırakılabilir (Şekil 8). Ultra santrifüjleme ve filtrasyonla karşılaştırıldığında, daha yüksek verimli ekzosomlar kısa sürede geri kazanılabilir. Buna ek olarak, mikroakışkan çipler, mikrokanalda CD63 ( Song ve ark., 2020 ) ve PTK7 aptamerlerini kullanarak EV'leri özel olarak yakalamak için polidimetilsiloksan ve camdan oluşur. CLIKKPF (daha yüksek afiniteli peptit), fosfatidilserin ve CLIKKPF ( Yang ve ark., 2022b ) arasındaki yüksek afinite ile ekzosomları yakalamak için SiO2 mikroküreler üzerinde immobilize edildi . Kim ve ark. (2022b), EV'lerin fiziksel adsorpsiyon yoluyla sitratla kaplı bir plazma altın yüzeyine antikorların (örneğin, CD63 antikoru) adsorpsiyonu ile yakalanabileceğini ve bunun daha yüksek verimlilik ve özgüllük gösterdiğini belirtti.

ŞEKİL 8

sEV-IsoPD'nin şeması. (A) Cihaz bir peristaltik pompa, dört hücreli kap, valfler ve filtre tutucudan oluşur. (B) sEV-IsoPD'nin akış sisteminin şematik diyagramı. (C) PC membranının şeması ve Ab@MOF@paper'ın üretimi. (D) sEV'leri sEV-IsoPD ile yakalama, serbest bırakma ve tespit etme süreci. ( Seo ve diğerleri, 2022 )'den izin alınarak yeniden üretilmiştir.

Zheng ve arkadaşları (2022), gözyaşı damlası şeklindeki mikropüler dizilime sahip bir mikroakışkan çip tasarladılar. Ekzosomlar, Tim4 ile modifiye edilmiş manyetik boncuklar (Tim4 boncukları) tarafından yakalandı. Damla şeklindeki mikrokolon dizileri, yakalama sürecinde önemli bir rol oynar. Tim4 boncukları tarafından ekzosomların yakalanması Ca 2+ ' ya bağlıdır . Sağlam ekzosomlar, şelatörler kullanılarak serbest bırakılabilir. Bu nedenle, ekzosomların biyoaktivitesi ve morfolojik bütünlüğü yüksek verimlilik ve hassasiyetle korunabilir. Dahası, DNAzyme tetiklemeli sistemin bireysel sEV'leri kümeler halinde toplaması önerildi ( Yu ve arkadaşları, 2022a ). Bu sistemde, kolesterol kuyruklu DNAzyme probları, ekzosomları zenginleştirmek için CD63 aptamer ile modifiye edilmiş substrat problarına hibridize edildi. Ekzosomlar, ultra santrifüjleme olmadan hızla izole edilebilir. Ekzosomları tespit etmek için tekrarlanabilir sıcaklığa duyarlı elektrokimyasal biyosensör oluşturuldu ( Liu ve diğerleri, 2022a ).

3.3 Kovalent kimya ile ekzosomların yakalanması

Ewing sarkomu (ES) türevi EV'lerin spesifik saflaştırılması, ES-EV Click Chip ( Dong ve diğerleri, 2020 ) kullanılarak gerçekleştirilebilir. Si nanotelleri mikroçipe gömülür ve daha sonra EV'lerin kovalent kimya aracılı yakalanmasıyla birleştirilir. Çip, bir Tz-aşılanmış SiNWS ve yılan gibi bir mikrokanala sahip PDMS tabanlı kaotik bir karıştırıcıdan oluşur. Tz, Tz-sülfo-NHS esterinin SiNWS üzerindeki NHS esteriyle reaksiyonu yoluyla Si nanotelleri üzerinde immobilize edildi ve Tz-aşılanmış SiNWS elde edildi. Kaotik karıştırıcı, eksiksiz bir ES-EV Click çipi yapmak için mikroakışkan iskele yoluyla Tz-aşılanmış SiNWS ile birleştirilir. LINGO-1, immunogold-TEM ile ES EV'lerin yüzeyinde ifade edildiği bulunan ES'nin spesifik bir belirtecidir. ES EV'ler anti-LINGO-1 tarafından özel olarak tanınabilir ve konjuge edilebilir. Anti-LINGO-1 üzerindeki birincil amin grubu TCO-PEG4-NHS esteri ile reaksiyona sokularak TCO-anti-LINGO-1 konjugatı oluşturuldu. Tz ve TCO kısımları arasındaki ters elektron talebi Diels-Alder (IEDDA) reaksiyonu, Tz-greftli SiNWS üzerindeki EV'leri yakalamak için kullanıldı. EV'ler disülfür bağı kesme ajanları (1,4-ditiyotreitol, DTT gibi) aracılığıyla serbest bırakıldı . ES türevi EV'lerin özel saflaştırılması, EV'lerin ES-EV Click Chip'i tarafından sağlanırken, EV'lerin bütünlüğü korunur. Çip, ES EV'lerin aşağı akış fonksiyonlarının incelenmesi için uygundur.

Liu X ve diğerleri, plazma örneklerinden ekzosomların etkili bir şekilde çıkarılması için uyarı aracılı bir ekzosom zenginleştirme ve saflaştırma sistemi önermiştir ( Liu ve diğerleri, 2022b ). Ekzosomların hedeflenen zenginleştirilmesi ve saflaştırılması, ekzosomların lipit çift katmanlarına spesifik uyarıya karşılık gelen kopolimerlerin yerleştirilmesiyle gerçekleştirilebilir. N-izopropilakrilamid (NIPAM) ve N-akriloiloksisüksinimid (NAS), PNN oluşturmak için geri dönüşümlü ekleme-parçalanma zincir transferi (RAFT) yoluyla polimerize edildi . PNN-SA, PNN ve streptavidin (SA) tarafından bir karbodiimid çapraz bağlayıcı (Şekil 9). DSPE-SS-Biyotin, biyotin kuyruğu açıkta kalacak şekilde ekzosomların lipit çift katmanına yerleştirilir. PNN kaplı ekzosomlar (PNN-Eksos), demirlenmiş biyotin etiketi ve PNN-SA arasındaki etkileşimle üretilir. Alt kritik çözelti sıcaklığı (LCST) 31°C'dir. PNN, oda sıcaklığında 25°C'de sulu çözeltide çözünür (T < LCST). Artan sıcaklıkla (T > LCST) PNN, faz ayrılmasına ve çökelmeye yol açan geri dönüşümlü hidrofilik-hidrofobik çöküşe uğrar ve çözelti berraktan bulanık hale gelir. Geleneksel izolasyon yöntemleriyle (örneğin, ultra santrifüjleme, ExoQuick) karşılaştırıldığında, bu sistem ekzosomların biyoaktivitesini daha yüksek verim ve saflıkla etkili bir şekilde koruyabilir. Ek olarak, sistem mikroRNA'lar gibi ilgili ekzosom biyobelirteçlerini karakterize etmek için belirli analitik araçlarla birleştirilebilir. Ancak bu sistem daha büyük EV'lere uygulanamamaktadır ve prospektif çalışmalar için daha geniş klinik kohortlarda doğrulama gerekmektedir.

ŞEKİL 9

PNN-SA ve DSPE-SS-Biotin'in moleküler yapıları. DSPE-SS-Biotin, ekzosomların lipit çift katmanına yerleştirilebilir ve çıplak biyotin, ekzosomları yakalamak için PNN-SA ile etkileşime girer. İşlem sıcaklığa bağlıdır. ( Zhang ve diğerleri, 2022c ) izniyle yeniden üretilmiştir.

EV'lerin hızlı bir şekilde yakalanmasını sağlamak için Sun ve ark. (2022) Click Beads konseptini önerdi. TCO-PEG-NHS, DSPE-PEG 1000 -TCO konjugatlarını oluşturmak için DSPE-PEG 1000 -NH 2 ile birlikte inkübe edildi. EV'ler, DSPE-PEG 1000 -TCO'nun lipit motifinin EV membranına yerleştirilmesiyle etiketlendi . TCO etiketli EV'ler, TCO ve Tz motifleri arasındaki biyoortogonal bir click kimya reaksiyonu ile Click Beads üzerinde yakalandı. Click Beads üzerindeki izole edilmiş ekzosomlar santrifüjleme ile tüplere toplandı. Geleneksel izolasyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, Click Beads zaman kazandırıcı ve verimlidir ve birden fazla kanser kaynaklı ekzosomun yakalanmasına ve RT-dPCR ile akış aşağı analizine olanak tanır. Ayrıca, ekzosomların daha ileri analizi, tek adımlı termoforetik AND kapısı işlemi (Tango) testiyle birlikte denenebilir ( Deng ve diğerleri, 2022 ).

Sorunu çözmek için biyosıvılardan eksozomları verimli bir şekilde izole etmek zordur, yeni bir mikrogirdap çipi oluşturulmuştur. EV'ler, lipit nanoprobu modifiye edilmiş Morpho Menelaus (M. Menelaus) kanatlarının mikroakışkan çiplere entegre edilmesiyle verimli bir şekilde ayrılabilir ( Han ve diğerleri, 2020 ). DSPE-PEG-biyotin lipit nanoprobu çözeltisi, afin kaplı M. Menelaus kanatlarıyla birlikte inkübe edildi ve lipit nanoprobu modifiye edilmiş M. Menelaus kanatları elde etmek için biyotin-avidin reaksiyonu kullanıldı. Lipit kuyruğu, eksozom yakalanması için EV'lerin membranına yerleştirilebilir. Ayrıca, çip tarafından akış aşağı analizine izin verilir (Şekil 10). Meme kanseri hücresinden türetilen EV'lerden GPC-1 mRNA, işlevsel doğrulama için kullanılır. Bu yeni mikrovorteks çipinin, %70'e varan bir verimlilikle EV'lerin yüksek verimli zenginleştirilmesini sağladığı bildirilmiştir. Doğal M. Menelaus kanadı, yüzeyde paralel olarak düzenlenmiş bir dizi kesişen nokta bağlantılı 3B mikro oluk yapısına sahiptir ve EV izolasyonu için mikrovorteksler üretir.

ŞEKİL 10

M. Menelaus kanadının lipit nanoproblarla modifikasyonu ve sürecin farklı aşamalarındaki M. Menelaus kanatlarının SEM görüntüleri. (A) M. Menelaus kanadı yüzeyindeki lipit nanoprobların modifikasyon sürecinin şematik diyagramı. (B, C) Kanat yapısının SEM görüntüsü. (D) EV'lerin TEM görüntüsü. (E) Lipit nanoprob modifikasyonu olmaksızın M. Menelaus kanadı tarafından yakalanan EV'lerin SEM görüntüsü. (F) Lipit nanoproblarla modifiye edilmiş M. Menelaus kanadı tarafından yakalanan EV'lerin SEM görüntüsü (beyaz okla gösterilmiştir). (G) Trietilamin ile işlemden sonra M. Menelaus kanadı tarafından yakalanan EV'lerin SEM görüntüsü. ( Han ve ark., 2020 ) izniyle yeniden üretilmiştir .

3.4 Diğer stratejiler

Tulkens ve ark. (2020), bakteriyel kaynaklı EV'leri izole etmek için sırayla ultrafiltrasyon, boyut dışlama kromatografisi ve yoğunluk gradyan santrifüjlemesini birleştirerek EV'lerin bütünlüğünü garantiledi ve etiketleme ihtiyacını ortadan kaldırdı ve izole edilmiş EV'lerin sonraki karakterizasyonunu kolaylaştırdı. Ek olarak, ekzosomlar CD9-HPLC-IAC ( Zhu ve ark., 2021 ) ve dokunulmadan izolasyon ( Yu ve ark., 2022b ) ile de izole edilebilir. Rekombinant EV'ler hastalık teşhisi ve tedavisi için kademeli olarak geliştirilmektedir ( Geeurickx ve ark., 2019 ). Ekzosom alımı ve içerik taşıma süreci netleşmektedir ( Bonsergent ve ark., 2021 ). Doğal ekzosomların üç saat içinde kan dolaşımından temizlenmesi sorununu çözmek için Lathwal ve ark. (2021), ekzosomları in vitro daha kararlı hale getirmek için ekzosom-polimer hibriti tasarladılar . Yukarıdan aşağıya veya aşağıdan yukarıya stratejilerle hazırlanan ekstraselüler vezikül taklitleri klinik uygulamalar için büyük potansiyele sahiptir ( Liu ve ark., 2022c ). Yukarıda gösterilen bu yaklaşımlar, ekzosomları daha iyi izole etme çabalarına odaklanmıştır.

Git:

4 Zorluklar ve geleceğe bakış

Ekzosomlar, potansiyel klinik uygulamaları nedeniyle son birkaç on yılda yoğun ilgi görmüştür. Günümüzde, ekzosomların ayrılması için birçok yöntem ve teknoloji geliştirilmiştir. Bu bölümde, mevcut ekzosom ayırma yöntemlerinin zorluklarını ve beklentilerini tartışıyoruz. Ekzosomların heterojenliği ve matrisin karmaşıklığı nedeniyle, yüksek saflıkta, verimde ve geri kazanımda ekzosom ayırma bir zorluk olmaya devam etmektedir. Mevcut ekzosom ayırma yöntemleri esas olarak boyutlarına ve yüzeye özgü proteinlere bağlıdır. Boyuta dayalı yöntemler etiketsizdir, ancak düşük saflıktan muzdariptir. İmmünoafinite yöntemleri ekzosomları kısa sürede izole edebilir, ancak bunlar ekzosomların yüzeyindeki belirteçlerin özgüllüğüne bağlıdır. Ancak, yaygın olarak kullanılan belirteçler tamamen ekzosomlara özgü değildir. İzolasyon yönteminin seçimi, örneğin ekzosom genomiği ve proteomikleri ile ilgili çalışmalar ve hastalıkların tedavisinde ekzosomların rolü gibi takip eden araştırmalar için çok önemlidir.

4.1 Ekzosomların saflığı ve geri kazanımı nasıl iyileştirilir

Ekzom ayrımının düşük saflığı esas olarak çok sayıda eş-izole edilmiş kirleticiden kaynaklanır. Özellikle eş-izole edilmiş ekzom dışı işlevsel veziküller sonraki deneyleri etkileyecektir. Ayrıca yoğunluk ve boyut açısından ekzomlarla örtüşen çok sayıda eş-izole edilmiş protein de vardır. Bu nedenle, kontaminasyonlar olmadan biyolojik sıvılardan ekzomları izole etmek zordur ve bu da izole edilmiş ekzomların saflığını etkileyebilir.

İzolasyonun saflığını artırmak için çözülmesi gereken ilk sorun, ekzosomlar ile diğer vezikül olmayan bileşenler arasındaki boyut, yoğunluk, yüzey proteini ve diğer fizikokimyasal özelliklerdeki belirli farklılıkları belirlemektir. Örneğin, immünoafinite yakalama, ekzosomlardaki yüzeye özgü belirteçlere göre ekzosomlara bağlanmak üzere uygun antikorlar veya aptamerler seçilerek daha yüksek saflık elde edilebilir. Şu anda, ultra santrifüjleme ile boyut dışlama kromatografisinin birleştirilmesi gibi, yüksek saflıktaki ekzosomların izolasyonu ve geri kazanımı için birden fazla yöntemin kombinasyonları uygulanmaktadır. Kapsamlı yöntem, yüksek saflıktaki ekzosomların etiketsiz geri kazanımını iyileştirmek için mükemmel bir performansa sahiptir. Ancak, kapsamlı yöntemlerle ekzosomların izolasyonu üzerine çok az çalışma vardır. Bu yöntemin geliştirilmesini teşvik etmek için çok fazla çalışma yapılması gerekmektedir.

4.2 Ekzosomların biyoaktivitesi ve morfolojik bütünlüğü

Dış kuvvetlerdeki veya mikroçevredeki değişiklikler nedeniyle, bazı mevcut ayırma yöntemleri kaçınılmaz olarak eksozomların biyoaktivitesini ve morfolojik bütünlüğünü yok eder. Örneğin, yüksek dönen dış kuvvet ve filtrasyon membranının ekstrüzyonu eksozomlarda mekanik hasara neden olur. Eksozomların biyoaktivitesi ve yapısal bütünlüğü, doğal yer çekimine dayalı izolasyona dayanan boyut dışlama kromatografisinin kullanımı gibi dış hasardan makul bir şekilde kaçınılarak etkili bir şekilde korunabilir. Eksozomların biyoaktivitesi ve bütünlüğü, farklı biyolojik sıvılardaki fizikokimyasal özelliklerden veya eksozomlara özel olarak bağlanan maddelerden etkilenebilir. Kovalent kimya ile yakalama, eksozomların biyoaktivitesini ve bütünlüğünü etkili bir şekilde koruyabilir veya Ca 2+ -bağımlı Tim4 proteinleri gibi kolayca izole edilen maddeler kullanılarak da yapılabilir. Hastalık tedavisi ve eksozomların biyoloji çalışmaları için sağlam eksozomları verimli bir şekilde geri kazanmak çok önemlidir.

4.3 Yüksek verimli ve otomatik mikroakışkan

Mikroakışkan teknolojisi düşük tüketim, otomasyon ve taşınabilirlik nedeniyle oldukça umut verici olarak kabul edilir. Ancak, teknoloji yüksek maliyetli ve düşük verimlidir. Örneğin, doğal etiketsiz özellikler nedeniyle, deterministik yanal yer değiştirme, dielektroforetik, vb. ekzosomların geri kazanılması için büyük potansiyel göstermektedir. Ancak, bu yöntemler nispeten düşük saflıktan muzdariptir. Verimliliği ve ayırma hızını iyileştirmek esastır. Ekzosom izolasyonu için birçok mikroakışkan yöntem geliştirilmiş olsa da, hiçbiri klinik uygulamada yaygın olarak kullanılmamaktadır. Başlıca nedenlerden biri, mikroakışkan platformlarda klinik doğrulama için sınırlı sayıda numune bulunmasıdır. Bazı mikroakışkan çipler kültür ortamında iyi bir ayırma performansı elde edebilir. Ancak, numunenin karmaşıklığı nedeniyle, güvenilirliğini, duyarlılığını ve özgüllüğünü doğrulamak için çok sayıda klinik numuneye ihtiyaç vardır. Ancak, çok sayıda numuneyle klinik doğrulama kolay değildir ve daha fazla çaba göstermemizi gerektirir. Klinik ekzosom ayrımı için uygun mikroakışkan cihazın geliştirileceğine inanıyoruz.

Dikkat çekici uygulama beklentilerine rağmen, hala tartışılmaya değer bazı sorunlar var. Ekzosomların heterojenliği iyi anlaşılmamıştır, bu da farklı ayırma yöntemlerinin seçimini türevsel olarak etkileyebilir. Saflık, geri kazanım, verim vb. gibi dikkate alınması gereken çok sayıda ölçüt ile hangi yöntemin en iyi seçenek olduğunu söylemek zordur. Şu anda, en uygun yöntemlerin seçimi her bir özel araştırma gereksinimine ve uygulama senaryosuna dayanmalıdır. Saflığı ve verimi artırmak için birden fazla ayırma yönteminin kullanılmasıyla kapsamlı yöntem de önerilmektedir. Seçilen ayırma yönteminin çalışmalardan farklı olabilecek faktörlere dayalı olması gerektiği vurgulanmalıdır. Bu nedenle, ekzosom ayırma için tek tip bir yöntem yoktur.

Git:

5. Sonuç

Uygun izolasyon yöntemi/aracı ekzosom araştırmasının öncülüdür. Genel olarak, ekzosomların izolasyonu için kullanılan giderek daha fazla yöntem, ekzosomların biyoaktivitesini ve morfolojik bütünlüğünü korumada büyük ilerleme kaydetmiştir. Şimdiye kadar, birçok izolasyon yöntemi yalnızca yüksek izolasyon saflığını garantilemek için değil, aynı zamanda büyük bir işlevsel iyileştirme sağlayan yüksek izolasyon verimini sağlamak için de kullanılabilir. Ancak, her yöntemin kendine özgü avantajları ve dezavantajları vardır. Mikroakışkan sistemlerin ayrıca düşük örnek kapasitesi dezavantajı vardır. Yöntemlerin kombinasyonu, tamamlayıcı avantajlar yoluyla belirli sorunları çözmek için kullanılabilir, ancak yine de sınırlamalar vardır. Bu nedenle, basitlik, kolaylık, yüksek verim, yüksek saflık ve düşük maliyet avantajlarına sahip entegre bir izolasyon cihazı geliştirmek zordur. İzolasyon ekipmanlarının standardizasyonuna, entegrasyonuna ve yüksek verimliliğine giden yol engellerle dolu ve uzundur. Kapsamlı mikrodizilerin geliştirilmesi, ekzosom izolasyonu için umut verici bir yöntemdir, ekzosom alt grupları ve heterojenlik çalışması ise derinlemesine genişletilecektir. Yakın gelecekte araştırmacıların klinik uygulamaya yönelik son teknoloji ekzosom izolasyon yöntemi üzerinde çalışmalar yapacağı düşünülmektedir.

Referanslar

Alameldin S., Costina V., Abdel-Baset HA, Nitschke K., Nuhn P., Neumaier M., ve diğerleri (2021). Boyut dışlama kromatografisinin ultra santrifüjlemeye bağlanması, LC-MS ile insan plazmasından ekzosomal proteinlerin tespitini iyileştirir . Pract. Lab. Med. 26 , e00241. 10.1016/j.plabm.2021.e00241 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Ayala-Mar S., Perez-Gonzalez VH, Mata-Gomez MA, Gallo-Villanueva RC, Gonzalez-Valdez J. (2019). Dielektroforetik destekli PDMS tabanlı mikroakışkanlar kullanılarak elektrokinetik olarak yönlendirilen ekzosom ayrımı ve konsantrasyonu . Anal. Chem. 91 , 14975–14982. 10.1021/acs.analchem.9b03448 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Bathini S., Pakkiriswami S., Ouellette RJ, Ghosh A., Packirisamy M. (2021). Hücre dışı veziküllerin izolasyonu ve gen amplifikasyonu ile karakterizasyonu için manyetik parçacık tabanlı sıvı biyopsi çipi . Biosens. Bioelectron. 194 , 113585. 10.1016/j.bios.2021.113585 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Berger M., Scherer C., Noskov S., Bantz C., Nickel C., Schupp W., ve diğerleri (2021). Asimetrik akış alan akış fraksiyonasyonunda salınımlı ana akışın ayırma verimliliğine etkisi . J. Chromatogr. A 1640 , 461941. 10.1016/j.chroma.2021.461941 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Bonsergent E., Grisard E., Buchrieser J., Schwartz O., Thery C., Lavieu G. (2021). Memeli hücrelerinde ekstraselüler vezikül alımının ve içerik dağıtımının kantitatif karakterizasyonu . Nat. Commun. 12 , 1864. 10.1038/s41467-021-22126-y [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Boriachek K., Masud MK, Palma C., Phan HP, Yamauchi Y., Hossain MSA, ve diğerleri (2019). Ekzosom analizinde ön izolasyon adımından kaçınma: Altın yüklü nanogözenekli ferrik oksit nanozimleri kullanılarak ekzosomların doğrudan izolasyonu ve hassas tespiti . Anal. Chem. 91 , 3827–3834. 10.1021/acs.analchem.8b03619 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Cardoso RMS, Rodrigues SC, Gomes CF, Duarte FV, Romao M., Leal EC, ve diğerleri. (2021). Gelecekteki klinik kullanım için göbek kordonu kanından elde edilen küçük ekstraselüler veziküllerin izolasyonu için optimize edilmiş ve ölçeklenebilir bir yöntemin geliştirilmesi . Kök Hücre Transl. Med. 10 , 910–921. 10.1002/sctm.20-0376 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Chen W., Zhang Y., Di K., Liu C., Xia Y., Ding S., ve diğerleri. (2022). Meme kanseri kaynaklı ekzosomların yüksek verimli tespiti için yıkama gerektirmeyen ve kullanımı kolay bir floresan biyosensörü . Front. Bioeng. Biotechnol. 10 , 945858. 10.3389/fbioe.2022.945858 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Chen Y., Zhu Q., Cheng L., Wang Y., Li M., Yang Q., ve diğerleri (2021). Ultra hızlı izolasyon sistemi aracılığıyla ekzosom tespiti: Exodus . Nat. Yöntemler 18 , 212–218. 10.1038/s41592-020-01034-x [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Cheng J., Zhu N., Zhang Y., Yu Y., Kang K., Yi Q., ve diğerleri (2022). Ekzosomların yüksek verimli yakalanması ve salınması için kirpiden esinlenen immünomanyetik boncuklar . J. Mater Chem. B 10 , 4059–4069. 10.1039/d2tb00226d [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Chernyshev VS, Chuprov-Netochin RN, Tsydenzhapova E., Svirshchevskaya EV, Poltavtseva RA, Merdalimova A., ve diğerleri (2022). Asimetrik derinlik filtrasyonu: Düşük kontaminasyona sahip ekstraselüler veziküllerin yüksek verimli izolasyonu için çok yönlü ve ölçeklenebilir bir yöntem . J. Extracell. Vesicles 11 , e12256. 10.1002/jev2.12256 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Correll VL, Otto JJ, Risi CM, Main BP, Boutros PC, Kislinger T., ve diğerleri. (2022). Derinlemesine proteomik analiz için idrar içindeki ifade edilen prostat salgılarından küçük ekstraselüler vezikül izolasyonunun optimizasyonu . J. Extracell. Vesicles 11 , e12184. 10.1002/jev2.12184 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Crescitelli R., Lasser C., Lotvall J. (2021). Dokulardan ekstraselüler vezikül alt popülasyonlarının izolasyonu ve karakterizasyonu . Nat. Protokol 16 , 1548–1580. 10.1038/s41596-020-00466-1 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
D'Acunzo P., Kim Y., Ungania JM, Perez-Gonzalez R., Goulbourne CN, Levy E. (2022). Beyin dokularından mitokondri kökenli mitoveziküllerin ve mikrovezikül ve ekzosom alt popülasyonlarının izolasyonu . Nat. Protoc. 17 , 2517–2549. 10.1038/s41596-022-00719-1 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Deng J., Zhao S., Li J., Cheng Y., Liu C., Liu Z., ve diğerleri (2022). Ekstraselüler veziküllerde tek adımlı termoforetik ve kapı operasyonu prostat kanserinin teşhisini iyileştiriyor . Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 61 , e202207037. 10.1002/anie.202207037 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Dong J., Zhang RY, Sun N., Hu J., Smalley MD, Zhou A., ve diğerleri (2020). Nanoyapılı mikroçiplerin kovalent kimya ile birleştirilmesi, sarkoma kaynaklı ekstraselüler veziküllerin sonraki fonksiyonel çalışmalar için saflaştırılmasını mümkün kılmaktadır . Adv. Funct. Mater 30 , 2003237. 10.1002/adfm.202003237 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Droste M., Tertel T., Jeruschke S., Dittrich R., Kontopoulou E., Walkenfort B., ve diğerleri (2021). Görüntüleme akış sitometrisi ve nanopartikül izleme analizi ile gerçekleştirilen tek hücre dışı vezikül analizi, idrar hücre dışı vezikül hazırlama tekniklerinin doğruluğunu farklı şekilde değerlendirir . Int. J. Mol. Sci. 22 , 12436. 10.3390/ijms222212436 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Feng D., Ren M., Miao Y., Liao Z., Zhang T., Chen S., ve diğerleri (2022). Aptamer/grafen oksit bazlı FRET floresan ateşlemesiyle sıkıştırılmış manyetik baskılı polimer izolasyonu kullanan serumdaki ekzosomlar için çift seçici sensör . Biosens. Bioelectron. 207 , 114112. 10.1016/j.bios.2022.114112 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Fox LJ, Slastanova A., Taylor N., Wlodek M., Bikondoa O., Richardson RM, ve diğerleri. (2021). PAMAM dendrimerleri ve DOPC lipit çok katmanları arasındaki etkileşimler: Membran incelmesi ve yapısal bozukluk . Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj. 1865 , 129542. 10.1016/j.bbagen.2020.129542 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Geeurickx E., Tulkens J., Dhondt B., Van Deun J., Lippens L., Vergauwen G., ve diğerleri (2019). Biyolojik referans materyali olarak rekombinant hücre dışı veziküllerin üretimi ve kullanımı . Nat. Commun. 10 , 3288. 10.1038/s41467-019-11182-0 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Geng T., Song ZY, Xing JX, Wang BX, Dai SP, Xu ZS (2020). <p>Miyokard enfarktüsü olan hastaların koroner serumundan türetilen ekzosom, miRNA-143/IGF-IR yoluyla anjiyogenezi teşvik eder</p> . Int. J. Nanomedicine 15 , 2647–2658. 10.2147/IJN.S242908 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Guan S., Yu H., Yan G., Gao M., Sun W., Zhang X. (2020). Boyut dışlama kromatografisi ve ultra santrifüjleme ile saflaştırılan idrar ekzosomlarının karakterizasyonu . J. Proteome Res. 19 , 2217–2225. 10.1021/acs.jproteome.9b00693 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Guo J., Wu C., Lin X., Zhou J., Zhang J., Zheng W., ve diğerleri (2021). Klinik uygulamalara yönelik ekstraselüler veziküllerin izole edilmesi için basitleştirilmiş bir dikotomik boyut dışlama kromatografisinin kurulması . J. Extracell. Vesicles 10 , e12145. 10.1002/jev2.12145 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Guo K., Li Z., Win A., Coreas R., Adkins GB, Cui X., ve diğerleri (2021). DNA nanoyapısı tarafından etkinleştirilen tek hücre dışı veziküller üzerindeki yüzey proteinlerinin kalibrasyonsuz analizi . Biosens. Bioelectron. 192 , 113502. 10.1016/j.bios.2021.113502 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Gupta S., Rawat S., Arora V., Kottarath SK, Dinda AK, Vaishnav PK, ve diğerleri (2018). Mezenkimal kök hücrelerinin kültür süpernatantlarından ekzosom izolasyonu için doğaçlama tek adımlı sakaroz yastık ultra santrifüjleme yöntemi . Kök Hücre. Res. Ther. 9 , 180. 10.1186/s13287-018-0923-0 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Han C., Kang H., Yi J., Kang M., Lee H., Kwon Y., ve diğerleri. (2021). Tek vezikül görüntüleme ve bireysel ekstraselüler veziküllerin tetraspanin profillemesi için eş-yerleşim analizi . J. Extracell. Vesicles 10 , e12047. 10.1002/jev2.12047 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Han S., Xu Y., Sun J., Liu Y., Zhao Y., Tao W., ve diğerleri (2020). Morpho kelebeği kanat entegreli mikrovorteks biyoçipindeki ekstraselüler veziküllerin izolasyonu ve analizi . Biosens. Bioelectron. 154 , 112073. 10.1016/j.bios.2020.112073 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Han Z., Peng C., Yi J., Zhang D., Xiang X., Peng X., ve diğerleri (2021). Teğetsel akış filtrasyonuna dayalı mikroakışkan çip ile insan plazmasından yüksek verimli ekzosom saflaştırması . Sensörler Aktüatörler B Chem. 333 , 129563. 10.1016/j.snb.2021.129563 [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Hao N., Liu P., Bachman H., Pei Z., Zhang P., Rufo J., ve diğerleri (2020). Çok işlevli üç boyutlu çinko oksit nanodizilerinin akustofluidik destekli mühendisliği . ACS Nano 14 , 6150–6163. 10.1021/acsnano.0c02145 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Hassanpour Tamrin S., Sanati Nezhad A., Sen A. (2021). Mikroakışkan teknolojileri kullanılarak ekzosomların etiketsiz izolasyonu . ACS Nano 15 , 17047–17079. 10.1021/acsnano.1c03469 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Ho BD, Beech JP, Tegenfeldt JO (2020). Elektrokinetik deterministik yanal yer değiştirme kullanılarak hücre ayırma . Micromachines (Basel) 12 , 30. 10.3390/mi12010030 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Hochstetter A., Vernekar R., Austin RH, Becker H., Beech JP, Fedosov DA, ve diğerleri. (2020). Deterministik yanal yer değiştirme: Zorluklar ve perspektifler . ACS Nano 14 , 10784–10795. 10.1021/acsnano.0c05186 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Hu L., Zhang T., Ma H., Pan Y., Wang S., Liu X., ve diğerleri (2022). Hızlı izolasyon sistemiyle entegre gözyaşı ekzosom analiziyle hastalıkların sırrının keşfi: iTEARS . ACS Nano 16 , 11720–11732. 10.1021/acsnano.2c02531 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Kamei N., Nishimura H., Matsumoto A., Asano R., Muranaka K., Fujita M., ve diğerleri (2021). Yüksek saflıkta mezenkimal kök hücre kaynaklı ekstraselüler vezikül izolasyonunun yüksek geri kazanımı ve floresan boyalarla verimli etiketlenmesi için ticari protokollerin karşılaştırmalı çalışması . Nanomedicine 35 , 102396. 10.1016/j.nano.2021.102396 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Kang YT, Hadlock T., Jolly S., Nagrath S. (2020). Kanserle ilişkili ekstraselüler veziküllerin taranması ve kantifikasyonu için talep üzerine ekstraselüler veziküller (EVOD) çipi . Biosens. Bioelectron. 168 , 112535. 10.1016/j.bios.2020.112535 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Kang YT, Niu Z., Hadlock T., Purcell E., Lo TW, Zeinali M., ve diğerleri. (2021). Küçük hücreli olmayan akciğer kanserinde dolaşan NK hücresinden türetilen ekzosomların çip üzerindeki biyogenezisi antitümöral aktivite sergiliyor . Adv. Sci. (Weinh) 8 , 2003747. 10.1002/advs.202003747 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Kim K., Park J., Jung JH, Lee R., Park JH, Yuk JM, ve diğerleri. (2021). Hücre dışı veziküllerin izolasyonu için döngüsel teğetsel akış filtrasyon sistemi . Apl. Bioeng. 5 , 016103. 10.1063/5.0037768 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Kim K., Son T., Hong JS, Kwak TJ, Jeong MH, Weissleder R., ve diğerleri (2022). Afinite ligandlarının fiziksel emilimi, plazmonik altın substratlarına düşük non-spesifik bağlanma ile ekstraselüler vezikül tespitini kolaylaştırır . ACS Appl. Mater Interfaces 14 , 26548–26556. 10.1021/acsami.2c07317 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Kim YB, Lee GB, Moon MH (2022). Akış alanı-akış fraksiyonlaması/çok açılı ışık saçılması ve lipidomik karşılaştırma kullanılarak ekzosomların ve mikroveziküllerin boyut ayrımı . Anal. Chem. 94 , 8958–8965. 10.1021/acs.analchem.2c00806 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Kumar A., Dhadi SR, Mai NN, Taylor C., Roy JW, Barnett DA, ve diğerleri. (2021). Polisakkarit kitosan, çoklu biyosıvılardan küçük ekstraselüler veziküllerin izolasyonunu kolaylaştırır . J. Extracell. Vesicles 10 , e12138. 10.1002/jev2.12138 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Langevin SM, Kuhnell D., Orr-Asman MA, Biesiada J., Zhang X., Medvedovic M., ve diğerleri (2019). Verim, saflık ve pratiklik arasında denge: İnsan serumundan küçük ekstraselüler veziküllerin verimli izolasyonu için değiştirilmiş bir diferansiyel ultra santrifüjleme protokolü . RNA Biol. 16 , 5–12. 10.1080/15476286.2018.1564465 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Lathwal S., Yerneni SS, Boye S., Muza UL, Takahashi S., Sugimoto N., ve diğerleri (2021). Atom transfer radikal polimerizasyonu ile ekzosom polimer hibritlerinin mühendisliği . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 118 , e2020241118. 10.1073/pnas.2020241118 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Leong SY, Ong HB, Tay HM, Kong F., Upadya M., Gong L., ve diğerleri. (2022). Hücre dışı veziküller ve plazma protein ayrımı için mikroakışkan boyut dışlama kromatografisi (μSEC) . Small 18 , e2104470. 10.1002/smll.202104470 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Li K., Wong DK, Hong KY, Raffai RL (2018). Yastıklanmış yoğunluk gradyanlı ultra santrifüjleme (C-dguc): Ekzosomların izolasyonu, karakterizasyonu ve kullanımı için rafine edilmiş ve yüksek performanslı bir yöntem . Yöntemler Mol. Biol. 1740 , 69–83. 10.1007/978-1-4939-7652-2_7 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Li L., Zhao J., Zhang Q., Tao Y., Shen C., Li R., ve diğerleri (2021). Kanser hücrelerinden türetilen ekzosomlar, hedgehog yoluyla HCC tümör oluşumunu teşvik eder . Ön. Oncol. 11 , 756205. 10.3389/fonc.2021.756205 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Li Q., Wang Y., Xue Y., Qiao L., Yu G., Liu Y., ve diğerleri (2022). 3 boyutlu kendiliğinden birleşen nanoyapılı SiO2 mikroakışkan çip kullanılarak ekzosomların ultra hassas analizi . ACS Appl. Mater Arayüzleri 14 , 14693–14702. 10.1021/acsami.1c22569 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Lim J., Kang B., Son HY, Mun B., Huh YM, Rho HW, ve diğerleri (2022). Sinyal yükseltilebilir 3 boyutlu nanoyapı kullanılarak kanda meme kanseri kaynaklı ekzosomal mRNA'nın tek adımda tespiti için mikroakışkan cihaz . Biosens. Bioelectron. 197 , 113753. 10.1016/j.bios.2021.113753 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Liu C., Wang Y., Li L., He D., Chi J., Li Q., ve diğerleri (2022). Kanser immünoterapisi için tasarlanmış ekstraselüler veziküller ve taklitleri . J. Control Release 349 , 679–698. 10.1016/j.jconrel.2022.05.062 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Liu D., Tang J., Xu H., Yuan K., Aryee AA, Zhang C., ve diğerleri. (2022). Tümör ekzosomlarının tespiti için bölünmüş aptamer aracılı rejeneratif sıcaklık duyarlı elektrokimyasal biyosensör . Anal. Chim. Acta 1219 , 340027. 10.1016/j.aca.2022.340027 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Liu HY, Kumar R., Zhong C., Gorji S., Paniushkina L., Masood R., ve diğerleri (2021). Lipid yama mikrodizileri ile kanser ekstraselüler veziküllerinin hızlı yakalanması . Adv. Mater 33 , e2008493. 10.1002/adma.202008493 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Liu X., Zong Z., Liu X., Li Q., Li A., Xu C., ve diğerleri (2022). Kanser biyobelirteçlerinin yüksek verimli profillemesi için kan plazmasından uyaran aracılı ekzosomların spesifik izolasyonu . Küçük Yöntemler 6 , e2101234. 10.1002/smtd.202101234 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Liu Y., Zhao W., Cheng R., Logun M., Zayas-Viera MDM, Karumbaiah L., ve diğerleri. (2020). Ekzosom benzeri nanopartiküllerin etiketsiz ferrohidrodinamik ayrımı . Lab. Chip 20 , 3187–3201. 10.1039/d0lc00609b [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Lu Y., Ye L., Jian X., Yang D., Zhang H., Tong Z., ve diğerleri (2022). Ekzosomu izole etmek ve protein belirteci PD-L1'i analiz etmek için entegre mikroakışkan sistem . Biosens. Bioelectron. 204 , 113879. 10.1016/j.bios.2021.113879 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Luo Y., Gao D., Wang P., Lou C., Li T., Niu W., ve diğerleri (2021). İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden türetilen küçük ekstraselüler vezikülleri izole etmek için optimize edilmiş kültür yöntemleri . J. Extracell. Vesicles 10 , e12065. 10.1002/jev2.12065 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Manning RR, Holcomb RE, Katayama DS, Payne RW, Stillahn JM, Henry CS ve diğerleri (2021). Asimetrik akış alanı akış fraksiyonasyonu (AF4) kullanılarak peptitlerin analizi . J. Pharm. Sci. 110 , 3969–3972. 10.1016/j.xphs.2021.09.036 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Mao D., Zheng M., Li W., Xu Y., Wang C., Qian Q., ve diğerleri (2022). Sınırlı alanlarda ekzosomal miRNA'ların doğru tespiti için kübik DNA nanokafes tabanlı üç boyutlu moleküler işaret . Biosens. Bioelectron. 204 , 114077. 10.1016/j.bios.2022.114077 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Marioli M., Kavurt UB, Stamatialis D., Kok WT (2019). Asimetrik akış alan akış fraksiyonlamasında tutmayı, seçiciliği ve çözünürlüğü artırmak için mikro yapılandırılmış membranların uygulanması . J. Chromatogr. A 1605 , 360347. 10.1016/j.chroma.2019.07.001 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Mondal SK, Whiteside TL (2021). Melanom hastalarının plazmasından melanom hücresinden türetilen ve T hücresinden türetilen ekzosomların immünoafiniteye dayalı izolasyonu . Yöntemler Mol. Biol. 2265 , 305–321. 10.1007/978-1-0716-1205-7_23 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Neves KB, Rios FJ, Sevilla-Montero J., Montezano AC, Touyz RM (2022). Ekzosomlar ve kardiyovasküler sistem: Kardiyovasküler sağlık ve hastalıktaki rolü . J. Physiol . 10.1113/JP282054 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Pan H., Dong Y., Gong L., Zhai J., Song C., Ge Z., ve diğerleri. (2022). MoS2 tabanlı SERS aptasensörü ile mide kanseri ekzosomlarının algılanması . Biosens. Bioelectron. 215 , 114553. 10.1016/j.bios.2022.114553 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Pan Y., Ma T., Meng Q., Mao Y., Chu K., Men Y., ve diğerleri (2020). Mutlak gen kantifikasyonu için mikroakışkan darbeli baskı ile etkinleştirilen damlacık dijital PCR . Talanta 211 , 120680. 10.1016/j.talanta.2019.120680 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Park J., Park JS, Huang CH, Jo A., Cook K., Wang R., ve diğerleri (2021). Kan plazmasından tümör ekstraselüler veziküllerinin hızlı profillenmesi için entegre bir manyeto-elektrokimyasal cihaz . Nat. Biomed. Eng. 5 , 678–689. 10.1038/s41551-021-00752-7 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Patel Y., Janusas G., Palevicius A., Vilkauskas A. (2020). Akustoforez yöntemi kullanılarak nano filtrasyon için nano gözenekli AAO membranının geliştirilmesi . Sensörler (Basel) 20 , 3833. 10.3390/s20143833 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Qian J., Zhang Q., Liu M., Wang Y., Lu M. (2022). Ekzosomal mikroRNA'ların izotermal amplifikasyonu ve tespiti için taşınabilir bir sistem . Biosens. Bioelectron. 196 , 113707. 10.1016/j.bios.2021.113707 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Ren Y., Ge K., Sun D., Hong Z., Jia C., Hu H., ve diğerleri (2022). Bir mikroakışkan çipteki fosfolipitleri ve transmembran proteini ölçerek ekstraselüler veziküllerin hızlı zenginleştirilmesi ve hassas tespiti . Biosens. Bioelectron. 199 , 113870. 10.1016/j.bios.2021.113870 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Rodriguez-Quijada C., Dahl JB (2021). Tek apoptotik cisimlerin temassız mikroakışkan mekanik özellik ölçümleri . Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj. 1865 , 129657. 10.1016/j.bbagen.2020.129657 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Roy JW, Taylor CA, Beauregard AP, Dhadi SR, Ayre DC, Fry S., ve diğerleri (2021). Çoklu omik profillemeyi mümkün kılan Vn96 izole edilmiş plazma hücre dışı vezikülleri ve hücresiz DNA için çok parametreli bir çıkarma yöntemi . Sci. Rep. 11 , 8085. 10.1038/s41598-021-87526-y [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Seo N., Nakamura J., Kaneda T., Tateno H., Shimoda A., Ichiki T., ve diğerleri (2022). Anyon değişim yöntemi ile nükleik asit kargo olarak işlevsel ekzosomları ve diğer hücre dışı vezikülleri ayırt etme . J. Extracell. Vesicles 11 , e12205. 10.1002/jev2.12205 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Shi L., Rana A., Esfandiari L. (2018). Sağlıklı donörlerin plazmasından çıkarılan nanopartiküllerin ve ekzosomların hızlı bir şekilde yakalanması için düşük voltajlı bir nanopipet dielektroforetik cihaz . Sci. Rep. 8 , 6751. 10.1038/s41598-018-25026-2 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Shrivastava S., Ray RM, Holguin L., Echavarria L., Grepo N., Scott TA, ve diğerleri. (2021). HIV-1'in ekzosom aracılı stabil epigenetik baskılanması . Nat. Commun. 12 , 5541. 10.1038/s41467-021-25839-2 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Shu S., Allen CL, Benjamin-Davalos S., Koroleva M., MacFarland D., Minderman H., ve diğerleri. (2021). Melanom hücre hatlarından eksozom izolasyonu için ultrafiltrasyon ve boyut dışlama kromatografisi (REIUS) yöntemini kullanan hızlı bir eksozom izolasyonu . Yöntemler Mol. Biol. 2265 , 289–304. 10.1007/978-1-0716-1205-7_22 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Silva AM, Lazaro-Ibanez E., Gunnarsson A., Dhande A., Daaboul G., Peacock B., ve diğerleri. (2021). Tek vezikül ve tek molekül çözünürlüğünde tasarlanmış ekstraselüler veziküllere protein kargo yüklemesinin kantifikasyonu . J. Extracell. Vesicles 10 , e12130. 10.1002/jev2.12130 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Smith JT, Wunsch BH, Dogra N., Ahsen ME, Lee K., Yadav KK, ve diğerleri (2018). Klinik açıdan önemli biyolojik örnek hacimlerinden ekstraselüler veziküllerin ayrılması için entegre nanometre ölçeğinde deterministik yanal yer değiştirme dizileri . Lab. Chip 18 , 3913–3925. 10.1039/c8lc01017j [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Song F., Wang C., Wang C., Wang J., Wu Y., Wang Y., ve diğerleri (2022). Tek hücreli heterojenliği keşfetmek için çok fenotipik ekzosom salgılama profili mikroakışkan platformu . Küçük Yöntemler 6 , e2200717. 10.1002/smtd.202200717 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Song Z., Mao J., Barrero RA, Wang P., Zhang F., Wang T. (2020). Verimli kanser immünokimyası ve immünoafinite tabanlı ekzosom izolasyonu için bir CD63 aptamerinin geliştirilmesi . Molecules 25 , 5585. 10.3390/molecules25235585 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Sun N., Tran BV, Peng Z., Wang J., Zhang C., Yang P., ve diğerleri (2022). Lipid etiketleme ve tıklama kimyasının birleştirilmesi, onkojenik gen değişikliklerinin invaziv olmayan tespiti için ekstraselüler veziküllerin izolasyonunu mümkün kılar . Adv. Sci. (Weinh) 9 , e2105853. 10.1002/advs.202105853 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Tayebi M., Yang D., Collins DJ, Ai Y. (2021). Birleşik elektrik ve akustik alan kullanılarak alt mikron parçacıkların ve hücre dışı veziküllerin deterministik olarak ayrılması . Nano Lett. 21 , 6835–6842. 10.1021/acs.nanolett.1c01827 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Taylor C., Chacko S., Davey M., Lacroix J., MacPherson A., Finn N., ve diğerleri (2020). Ekstraselüler veziküllerin ve hücresiz DNA'nın peptit afinitesi çökelmesi, akciğer kanseri hastası plazmasındaki patojenik mutasyonların tespiti için dizileme performansını iyileştirir . Int. J. Mol. Sci. 21 , 9083. 10.3390/ijms21239083 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Ter-Ovanesyan D., Norman M., Lazarovits R., Trieu W., Lee JH., Church GM, ve diğerleri. (2021). Hücre dışı vezikül izolasyon yöntemlerinin hızlı karşılaştırılması için çerçeve . eLife 10 , e70725. 10.7554/eLife.70725 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Thakur A., Xu C., Li WK, Qiu G., He B., Ng SP, ve diğerleri. (2021). Bir fare modelinde ekzosomal CD44 ve CD133'ün AFM ve LSPR tabanlı algılanmasıyla glioblastoma malignitesi için in vivo sıvı biyopsisi . Biosens. Bioelectron. 191 , 113476. 10.1016/j.bios.2021.113476 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Tulkens J., De Wever O., Hendrix A. (2020). Ortogonal biyofiziksel ayırma ve biyokimyasal karakterizasyon ile insan vücut sıvılarındaki bakteriyel ekstraselüler veziküllerin analizi . Nat. Protokolü 15 , 40–67. 10.1038/s41596-019-0236-5 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Turner NP, Abeysinghe P., Kwan Cheung KA, Vaswani K., Logan J., Sadowski P., ve diğerleri (2022). Proteomik analiz için kan plazması küçük ekstraselüler vezikül zenginleştirme stratejilerinin karşılaştırılması . Proteomlar 10 , 19. 10.3390/proteomlar10020019 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Ullah Khan N., Muhammad Z., Liu X., Lin J., Zheng Q., Zhang H., ve diğerleri (2021). Gümüş ada filmi üzerinde biyofonksiyonelleştirilmiş altın nanorodlar kullanılarak ekzosomun ultra hassas tespiti . Nano Lett. 21 , 5532–5539. 10.1021/acs.nanolett.1c00830 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Vergauwen G., Tulkens J., Pinheiro C., Avila Cobos F., Dedeyne S., De Scheerder MA, ve diğerleri. (2021). Klinik koşullar boyunca sistemik olarak dolaşan ekstraselüler veziküllerin biyomoleküler manzarasındaki değişiklikleri incelemek için kan plazmasının sağlam ardışık biyofiziksel fraksiyonlanması . J. Extracell. Vesicles 10 , e12122. 10.1002/jev2.12122 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Wang Z., Li F., Rufo J., Chen C., Yang S., Li L., ve diğerleri. (2020). Akustofluidik tükürük ekzosom izolasyonu: İnsan papilloma virüsüyle ilişkili orofaringeal kanser tespiti için sıvı biyopsi uyumlu bir yaklaşım . J. Mol. Diagn 22 , 50–59. 10.1016/j.jmoldx.2019.08.004 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Wang Z., Wang H., Becker R., Rufo J., Yang S., Mace BE, ve diğerleri (2021). Akustofluidik ayırma, dolaşımdaki ekzosomlara dayalı travmatik beyin hasarının erken teşhisini mümkün kılar . Microsyst. Nanoeng. 7 , 20. 10.1038/s41378-021-00244-3 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Wei Z., Zhao Y., Hsu P., Guo S., Zhang C., Zhong B. (2021). Gen terapisi için ekzosomlar, fare aort endotel hücrelerinde endotel-mezenkimal geçişi etkili bir şekilde inhibe eder . BMC Musculoskelet. Disord. 22 , 1000. 10.1186/s12891-021-04896-0 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Wu B., Chen X., Wang J., Qing X., Wang Z., Ding X., ve diğerleri (2020). Asimetrik akış alanı akış fraksiyonasyonu ile insan plazmasından ekstraselüler veziküllerin ayrılması ve karakterizasyonu . Anal. Chim. Acta 1127 , 234–245. 10.1016/j.aca.2020.06.071 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Wu J., Zeng D., Zhi S., Ye Z., Qiu W., Huang N., ve diğerleri (2021). Tümör kaynaklı bir ekzosom imzasının tek hücre analizi prognoz ve immünoterapi yanıtıyla ilişkilidir . J. Transl. Med. 19 , 381. 10.1186/s12967-021-03053-4 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Wu M., Ouyang Y., Wang Z., Zhang R., Huang PH, Chen C., ve diğerleri. (2017). Akustik ve mikroakışkanlığın entegre edilmesiyle tam kandan ekzosomların izolasyonu . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 114 , 10584–10589. 10.1073/pnas.1709210114 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Xiong H., Huang Z., Lin Q., Yang B., Yan F., Liu B., ve diğerleri (2022). Pankreas kanseri ekzosomlarının ultra hassas tespiti için polimer noktalar ve AuNP'lere dayalı yüzey plazmon kuplajlı elektrokemilüminesans immünosensörü . Anal. Chem. 94 , 837–846. 10.1021/acs.analchem.1c03535 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Xu Y., Li X., Niu C., Wu H., Yong Y., Qi C., ve diğerleri. (2022). Ekzosomal mikroRNA'nın hızlı ve kararlı floresan tespiti için Janus tel kafes DNA küp tabanlı 3B nanomakine . Biosens. Bioelectron. 212 , 114405. 10.1016/j.bios.2022.114405 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Yang K., Jia M., Cheddah S., Zhang Z., Wang W., Li X., ve diğerleri. (2022). Fosfatidilserin için spesifik afiniteye sahip peptit ligand-SiO2 mikroküreleri, ekzosomları izole etmek ve hepatik kanseri ayırt etmek için proteomikte uygulama için yeni bir strateji . Bioact. Mater 15 , 343–354. 10.1016/j.bioactmat.2021.12.017 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Yang Z., Atiyas Y., Shen H., Siedlik MJ, Wu J., Beard K., ve diğerleri. (2022). Yüksek verimli damlacık dijital enzim bağlı immünosorbent testi kullanılarak ultra hassas tek ekstraselüler vezikül tespiti . Nano Lett. 22 , 4315–4324. 10.1021/acs.nanolett.2c00274 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Yu X., Chen X., Sun Z., Niu R., Deng Y., Wang L., ve diğerleri. (2022). Ultra santrifüjleme gerektirmeyen zenginleştirme ve küçük hücre dışı veziküllerin kantifikasyonu . Anal. Chem. 94 , 10337–10345. 10.1021/acs.analchem.1c05491 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Yu Z., Lin S., Xia F., Liu Y., Zhang D., Wang F., ve diğerleri (2021). Mide kanseri hücrelerinden türetilen ekzosomların yüksek saflıkta immünomagnetik ayrımı ve yüksek hassasiyetli tespiti için ExoSD çipleri . Biosens. Bioelectron. 194 , 113594. 10.1016/j.bios.2021.113594 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Yu ZL, Liu XC, Wu M., Shi S., Fu QY, Jia J., ve diğerleri (2022). Dokunulmamış izolasyon, tümör dokularından tümör hücrelerinden türetilen ekstraselüler veziküllerin hedefli fonksiyonel analizini mümkün kılar . J. Extracell. Vesicles 11 , e12214. 10.1002/jev2.12214 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Zeng L., Chen X., Du J., Yu Z., Zhang R., Zhang Y., ve diğerleri (2021). Mikroakışkan bir cihazda ultra yüksek gradyanlı manyetik alanla nanometre ölçeğindeki parçacıkların etiketsiz ayrılması . Nanoscale 13 , 4029–4037. 10.1039/d0nr08383f [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Zeng L., Hu S., Chen X., Zhang P., Gu G., Wang Y., ve diğerleri. (2022). Etiketsiz ve biyouyumlu çip üstü manyetik ayırma ile küçük ekstraselüler veziküllerin çıkarılması . Lab. Chip 22 , 2476–2488. 10.1039/d2lc00217e [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Zhang H., Lyden D. (2019). Eksomer ve küçük ekstraselüler vezikül ayrımı ve karakterizasyonu için asimetrik akışlı alan akışlı fraksiyonlama teknolojisi . Nat. Protokolü 14 , 1027–1053. 10.1038/s41596-019-0126-x [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Zhang J., Zhu Y., Guan M., Liu Y., Lv M., Zhang C., ve diğerleri (2022). Dolaşımdaki ekzosomların izolasyonu ve immünoterapi yanıtını tahmin etmek için ekzomal PD-L1'in tanımlanması . Nanoscale 14 , 8995–9003. 10.1039/d2nr00829g [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Zhang L., Yin W., Tong Y., Zhang Y., Xu Y., Liu SY, ve diğerleri (2022). Kağıt tabanlı bir cihaz kullanılarak küçük ekstraselüler veziküllerin son derece verimli izolasyonu ve hassas tespiti . Anal. Chem. 94 , 10991–10999. 10.1021/acs.analchem.2c01378 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Zhang P., Zhou X., Zeng Y. (2019). Kanser erken teşhisine yönelik nano-mühendislikli ExoProfile çipi üzerindeki dolaşan ekzosomların çoklu immünofenotiplemesi . Chem. Sci. 10 , 5495–5504. 10.1039/c9sc00961b [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Zhang Y., Murakami K., Borra VJ, Ozen MO, Demirci U., Nakamura T., ve diğerleri. (2022). Benzersiz dielektrik özelliklerine dayalı ekstraselüler vezikül kümelerinin tespiti için etiketsiz bir elektriksel empedans spektroskopisi . Biosens. (Basel) 12 , 104. 10.3390/bios12020104 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Zhao L., Wang H., Fu J., Wu X., Liang XY, Liu XY, ve diğerleri (2022). Akciğer kanseri tanısı için mikroakışkan tabanlı ekzom izolasyonu ve son derece hassas aptamer ekzom membran proteini tespiti . Biosens. Bioelectron. 214 , 114487. 10.1016/j.bios.2022.114487 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Zhao W., Zhang L., Ye Y., Li Y., Luan X., Liu J., ve diğerleri (2021). Mikrosfer aracılı ekzom izolasyonu ve dielektroforez entegreli mikroakışkan bir cihazda ultra hassas tespit . Analist 146 , 5962–5972. 10.1039/d1an01061a [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Zheng L., Wang H., Zuo P., Liu Y., Xu H., Ye BC (2022). Kanserle ilişkili ekzosomların hızlı çip üzerinde izolasyonu ve ekzosomlar ile ekzomal proteinlerin birleşik analizi . Anal. Chem. 94 , 7703–7712. 10.1021/acs.analchem.2c01187 [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]
Zhu J., Zhang J., Ji X., Tan Z., Lubman DM (2021). Serum ekstraselüler veziküllerinin CD9-HPLC immünoafinite izolasyonu için kolon tabanlı teknoloji . J. Proteome Res. 20 , 4901–4911. 10.1021/acs.jproteome.1c00549 [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Akademik ]

Türkiye

Son Gelişmeler :

Ekzosomlar için izolasyon yöntemlerindeki son gelişmeler

Özet

1. Giriş

2 Ekzosom izolasyonu için geleneksel yöntemlerin iyileştirilmesi

Ekzosom izolasyonu için 3 yeni yöntem

3.1 Entegre mikroakışkan

3.1.1 Asimetrik akış alan akış fraksiyonasyonu

3.1.2 Deterministik yanal yer değiştirme

3.1.3 Dielektroforetik izolasyon

3.1.4 Akustik fraksiyonlama

3.1.5 Temassız mikroakışkanlar

3.1.6 Diğer yaklaşımlar

3.1.6.1 Ultra hızlı ekzom izolasyon sistemi ile yakalama

3.1.6.2 Santrifüjlü mikroakışkan disk sistemi ile yakalama

3.1.6.3 3D ZnO nanodizileri ile yakalama

3.2 Çip üzerinde immüno-yakalama

3.2.1 Lipid mikrodizileri

3.2.2 İmmunomanyetik boncuklarla yakalama

3.3 Kovalent kimya ile ekzosomların yakalanması

3.4 Diğer stratejiler

4 Zorluklar ve geleceğe bakış

4.1 Ekzosomların saflığı ve geri kazanımı nasıl iyileştirilir

4.2 Ekzosomların biyoaktivitesi ve morfolojik bütünlüğü

4.3 Yüksek verimli ve otomatik mikroakışkan

5. Sonuç

Referanslar

Son Yazılar

コメント

Eksozom hakkında haber, araştırma, kongre, seminer, webinar ve endüstri bilgilerini bulabileceğiniz bir portal.

Haber bültenimize abone olun